CN105861423A 一种猪icsi受精卵制备用操作皿的制作方法 （湖北省农业科学院畜牧兽医研究所）.docxVIP

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利申请

(10)申请公布号CN105861423A

(43)申请公布日2016.08.17

(21)申请号201610242170.X

(22)申请日2016.04.19

(71)申请人湖北省农业科学院畜牧兽医研究所地址430064湖北省武汉市洪山区南湖瑶

苑特1号

(72)发明人张立苹郑新民肖红卫刘西梅毕延震李莉华再东华文君

任红艳

(74)专利代理机构武汉帅丞知识产权代理有限公司42220

代理人朱必武

(51)Int.CI.

C12N5/073(2010.01)

权利要求书1页说明书5页附图1页

(54)发明名称

一种猪ICSI受精卵制备用操作皿的制作方法

(57)摘要

CN105861423A本发明设计一种猪ICSI受精卵制备用操作皿的制作方法，包括在Φ60mm的一次性细胞培养皿上依次制作设定尺寸的操作液微滴、用于制动的PVP微滴、注射针处理微滴、和精液培养微滴，所述精液培养微滴包括呈H型结构的第一精液培养微滴、精液筛选桥和第二精液培养微滴，利用精液筛选桥的作用，选取大量高质量精子。达到在短时间内实现大量猪ICSI操作目的，减少猪

CN105861423A

CN105861423A权利要求书1/1页

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1.一种猪ICSI受精卵制备用操作皿的制作方法，其特征在于：所述制作步骤及制作条件如下：

步骤一：用Gilson200微升移液器吸取150μL的TCM-199,在Φ60mm的一次性细胞培养皿的圆心沿X轴正负向做一个长2±0.2cm、宽0.5±0.1cm的长方形TCM-199操作液微滴(4),所述操作液微滴(4)用于放置猪卵母细胞并进行ICSI操作；设定所述一次细胞培养皿的圆心为原点；

步骤二：在按步骤一完成的操作液微滴(4)的上侧和下侧平行位置，各做一个与操作液微滴(4)平行且长宽尺寸相等的浓度为7%～9%的PVP微滴，其中：位于操作液微滴(4)上侧的是上PVP微滴(3)、位于位于操作液微滴(4)下侧的是下PVP微滴(5),所述上PVP微滴(3)和下PVP微滴(5)均用于精子的制动操作；

步骤三：分别在按步骤二中完成的上PVP微滴(3)的上侧和下PVP微滴(5)的下侧，各做三个10±1.0μL的浓度为7%～9%的PVP注射针处理微滴，其中：位于上PVP微滴(3)上侧的三个微滴是上注射针处理微滴(2)、位于下PVP微滴(5)下侧的三个微滴是下注射针处理微滴(6),所述上注射针处理微滴(2)和下注射针处理微滴(6)均用于显微注射针注射前的润洗以及，猪ICSI操作过程中管壁粘有精子时的注射针处理；

步骤四：在按步骤一完成的操作液微滴(4)的X轴负向紧靠培养皿的边缘部位，沿Y轴正负方向做一个高1±1.0cm、宽0.4±0.1cm的第一精液培养微滴(1.1),所述第一精液培养微滴(1.1)用于放置精子；再在所述精液培养微滴(1.1)的中部沿X轴正向，用受精液做一长1±0.1cm、宽0.1±0.05cm的用于精子游动的精液筛选桥(1.2);最后在所述精液筛选桥(1.2)的右端，沿Y轴正负方向做一高2±0.2cm、宽0.5±0.1cm的第二精液培养微滴(1.3);

步骤五：将石蜡油覆盖在按步骤一～步骤四制作完成的所有微滴及精液筛选桥(1.2)上；

步骤六：用显微注射针直接在第二精液培养微滴(1.3)中吸取质量较好的精子，再注射在上PVP微滴(3)或下PVP微滴(5)中进行制动，再在上PVP微滴(3)或下PVP微滴(5)中吸取制动后的精子，在操作液微滴(4)中进行注射，注射操作之前，先将注射针置于上注射针处理微滴(2)或下注射针处理微滴(6)共六个微滴中的任一个微滴中进行润洗，注射时，用固定针将卵母细胞的极体处于12点或者6点钟位置，注射针从卵母细胞的3点钟方向进去，注入精子后，轻轻反复回吸胞质，保证精子注射卵母细胞内，注射完成后轻轻退针，完成一个猪ICSI胚胎的制备；

所述步骤一中TCM-199操作液微滴(4)的配方为：添加7.5μg/mL细胞松弛素和4mg/mL牛血清白蛋白的HEPES缓冲的TCM-199;

所述步骤四中受精液的配方为：113.1mMNaCL,3mMKCL,7.5mMCaCL2.2H20,20mMTris,11mMGlucose,5mMSodiumpyruvate,100IU/m