利用CRISPR技术创建玉米雄性不育突变体及其应用研究.pdfVIP

摘要

作物雄性不育系的培育和维持是杂种优势利用的重要前提。基于传统育种手

段的雄性不育系培育具有周期长效率低等局限性，极大地限制了雄性不育系的广

泛应用。基因编辑技术可定向精准的修饰与遗传改良，打破了长期以来常规育种

技术瓶颈，现已成为引领性的生物育种前沿技术，在玉米种业及生产上具有巨大

应用潜力与价值。本研究利用基因编辑技术突变玉米TMS5基因，创制了玉米温敏

核雄性不育系，为第二代杂交育种技术奠定了技术与材料基础。同时，基于基因

编辑体内活性，利用课题组前期开发的可操控型细胞核雄性不育系，一步法创制

了主流商业杂交种的保持系和不育系材料，为第三代杂交育种技术的产业化应用

提供了重要的技术支持与材料基础。主要的研究结果如下：

在基因编辑创制温敏不育系研究方面：（1）利用CRISPR-Cas9基因编辑技术

创制tms5突变体。设计靶向ZmTMS5基因的sgRNA，靶向ZmTMS5基因的第一

外显子区域，构建基因编辑载体CPB-LTP2-DsRed2-NOS-U6-2-sgRNA-scaffold，通

KN558522T2

过农杆菌介导转化到玉米受体材料中，共获得份代转化材料。（）

0

tms5突变体基因分型和拷贝数鉴定。在22份T代突变体材料中鉴定到11种突变

0

3310

类型，其中纯合突变的有株，杂合突变的有株，双等位突变的有株，嵌合

体有4株，野生型材料有2株，突变频率为91%。利用qPCR技术对材料转基因

111132122

成分的拷贝数进行鉴定，结果显示编号为、、、和材料为单拷贝材料。

（3）tms5突变体表型及农艺性状鉴定。tms5突变株系布点播种在新乡高温试点，

并对材料的育性进行调研。结果发现tms5突变体株系花粉表现出不育的状态，平

均不育恢复率达5.2%。通过与tms5突变体株系及野生型材料的基本农艺性状调研，

结果发现在株高、穗位高、穗长、行粒数以及穗行数等数据二者无明显差异。

基因编辑介导的可操控型细胞核雄性不育系育种应用方面：（1）利用体内直

接突变体技术创制主流商业杂交种亲本Z372雄性不育系。本试验前期基于

CRISPR-Cas9靶向Ms26基因，同时创制了可利用荧光分选的保持系和不育系。本

试验将含有转基因成分CRISPR-Cas9的材料与受体材料Z372杂交，其中含有转基

因成分CRISPR-Cas9的材料体内带有CRISPR-Cas9编辑活性，可以直接对受体材

2-3F

料进行突变，之后利用受体材料回交代使受体材料背景纯合，杂交后的代

1

共收获20个果穗。（2）BCF世代分子鉴定及背景恢复率统计。对回交使用DsRed2

22

红色荧光分选标记和PCR扩增Cas9基因、Ms26基因进行三重筛选。Cas9基因扩

增无条带，Ms26基因扩增有外显子删除，DsRed2红色荧光分选标记为红色的是

MGM株系，与前面所述条件一致，但DsRed2红色荧光分选标记为不亮的是GMS

株系。结合液相芯片技术筛选背景高恢复率的，选择MGM和GMS材料各选10

MGM96.32%GMS

份样品送去检测，株系中背景恢复率最高的为，材料中背景恢