枸杞干果中5种有机酸的测定 液相色谱-串联质谱法.docxVIP

枸杞干果中5种有机酸的测定液相色谱-串联质谱法

1范围

本规程规定了采用液相色谱-串联质谱法测定枸杞干果中5种有机酸（柠檬酸、苹果酸、草酸、琥珀酸、酒石酸）含量的术语和定义、原理、试剂与材料、仪器设备、样品处理、色谱-质谱条件、测定步骤、结果计算、精密度、准确度及注意事项。

本规程适用于各类枸杞干果中上述5种有机酸的定量测定，检出限、定量限满足痕量检测需求，其他浆果类干果可参照执行。枸杞干果需符合GB/T18672-2002《枸杞(枸杞子)》相关要求，确保样品无霉变、无二氧化硫超标等问题。

2术语和定义

有机酸：本规程特指枸杞干果中天然存在的柠檬酸、苹果酸、草酸、琥珀酸、酒石酸，均为水溶性有机酸，具有特定的化学结构和质谱裂解特征，是枸杞风味和营养价值的重要组成部分。

液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）：将高效液相色谱的高效分离能力与串联质谱的高灵敏度、高选择性检测能力相结合，通过液相色谱实现样品中目标组分与基质杂质的分离，再经串联质谱进行离子化、裂解，根据特征母离子和子离子进行定性，外标法峰面积定量的分析方法。

母离子：目标化合物分子在离子源中失去或获得电子形成的分子离子峰，具有特定的质荷比（m/z），是串联质谱定性的基础。

子离子：母离子在碰撞室中与碰撞气体发生裂解反应后产生的碎片离子，具有特征性的质荷比，用于进一步确认目标化合物，提高检测的准确性和选择性。

回收率：样品中添加已知量的5种有机酸标准物质后，经前处理和检测，实际测得的标准物质含量与添加量的比值，用于评价方法的准确度。

精密度：在相同实验条件下，对同一均匀样品进行多次重复检测，测定结果的离散程度，通常用相对标准偏差（RSD）表示。

3原理

枸杞干果中的柠檬酸、苹果酸、草酸、琥珀酸、酒石酸经超纯水提取、超声辅助溶解后，通过离心、滤膜过滤去除样品中的大分子杂质、色素及不溶性颗粒物，实现样品净化。采用高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶或亲水作用色谱柱为固定相，适宜的缓冲液-有机相为流动相，对净化后的提取液进行洗脱分离，使5种有机酸与样品基质中的干扰组分有效分离。

分离后的目标组分进入串联质谱仪，采用电喷雾负离子源（ESI?）电离，选择反应监测模式（SRM）进行检测，根据各有机酸的特征母离子、子离子及保留时间进行定性确认；以标准系列溶液的峰面积对浓度绘制标准曲线，采用外标法计算样品中5种有机酸的含量。该方法可有效规避基质干扰，提高检测灵敏度和准确性，满足痕量水平的定量要求。

4试剂与材料

4.1试剂

除非另有说明，所用试剂均为分析纯，实验用水为超纯水（电导率≤18.2μS/cm，25℃）；流动相所用有机相为色谱纯，缓冲盐试剂为优级纯。

柠檬酸标准品（纯度≥99.5%）：编号、批号清晰，置于干燥密封容器中常温保存。

苹果酸标准品（纯度≥99.5%）：编号、批号清晰，置于干燥密封容器中常温保存。

草酸标准品（纯度≥99.5%）：编号、批号清晰，置于干燥密封容器中常温保存。

琥珀酸标准品（纯度≥99.5%）：编号、批号清晰，置于干燥密封容器中常温保存。

酒石酸标准品（纯度≥99.5%）：编号、批号清晰，置于干燥密封容器中常温保存。

甲醇（CH?OH）：色谱纯，用于配制流动相和标准溶液。

乙腈（CH?CN）：色谱纯，用于配制流动相，改善分离效果。

甲酸（HCOOH）：优级纯，用于调节流动相pH值，优化离子化效率。

乙酸铵（CH?COONH?）：优级纯，用于配制流动相缓冲液，提高分离选择性。

氨水（NH?·H?O）：优级纯，浓度25%～28%，用于调节样品提取液pH值（如需）。

4.2试剂配制

甲酸溶液（0.1%，v/v）：量取1mL甲酸，缓慢加入999mL超纯水中，搅拌均匀，经0.22μm有机相滤膜过滤后备用，用于流动相配制和标准溶液稀释。

乙酸铵缓冲液（10mmol/L）：称取0.7708g乙酸铵，加适量超纯水溶解，冷却后定容至1000mL，搅拌均匀，用甲酸微调pH至3.0～3.5，经0.22μm有机相滤膜过滤后备用。

混合标准储备液：分别精密称取柠檬酸、苹果酸、草酸、琥珀酸、酒石酸标准品各10.0mg，置于同一个100mL容量瓶中，加少量超纯水溶解，用0.1%甲酸溶液定容至刻度，摇匀，得到浓度为100μg/mL的5种有机酸混合标准储备液，4℃冷藏保存，有效期1个月，避免微生物污染。

混合标准工作液：精密量取混合标准储备液适量，用0.1%甲酸溶液逐级稀释，配制浓度为0.1μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL的混合标准工作液，现配现用，避免长时间放置导致浓度偏差。

流动相：甲醇-10mmol/L乙酸铵缓冲液（10:90，v/v），或乙腈-0.1%甲酸溶液（8:92，v/v），根据色谱分