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文献解读|免疫荧光＋AI赋能！肿瘤三级淋巴结构（TLS）量化新方案问世

在癌症治疗领域，肿瘤微环境中的免疫细胞“根据地”——三级淋巴结构（TertiaryLymphoidStructures，TLS）近年来备受关注。

这些结构不仅是免疫细胞的聚集地，更是预测患者预后和免疫治疗响应的关键指标。

在今年二月发表的《非小细胞肺癌三级淋巴结构专家共识》中也指出：

1.推荐选择6-7个合适的指标来检测三级淋巴结构——意味着多指标染色已成为主流检测发展趋势

2、共识七中还指出推荐有条件的医疗结构，使用mIHC来定量分析三级淋巴结构的密度、大小和数量等。

共识文件中指出：mIHC/mIF技术在保证分辨率的同时可兼顾全景成像,凭借视场大、颜色多、通量高的特点，

可在短时间内原位检测整张组织切片上的多种生物标志物的表达情况,借以识别组织上每个细胞表型、丰度、状态及其相互关系。

然而，传统TLS量化方法存在操作繁琐、主观性强、精度不足等痛点，严重制约了其在临床和科研中的应用。

近日，SarahGhamry-Barrin等学者在《TertiaryLymphoidStructures:MethodsandProtocols》中，提出了一套结合7重免疫荧光染色与HALO-AI自动化分析的完整方案，为人类肿瘤样本中TLS的精准量化提供了标准化路径。

今天就带大家深度拆解这篇极具实操价值的文献！

然而，传统TLS量化方法存在操作繁琐、主观性强、精度不足等痛点，严重制约了其在临床和科研中的应用。

近日，SarahGhamry-Barrin等学者在《TertiaryLymphoidStructures:MethodsandProtocols》中，提出了一套结合7重免疫荧光染色与HALO-AI自动化分析的完整方案，为人类肿瘤样本中TLS的精准量化提供了标准化路径。

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2、染色核心靶点：涵盖TLS关键组分与肿瘤细胞，研究团队采用TSA技术，实现了在同一组织切片上同时标记6种TLS相关细胞类型：

CD20+B细胞（橙色）

CD3+T细胞（蓝色）

pan-Cytokeratins+肿瘤细胞（灰色）

CD21+滤泡树突状细胞（黄色）

DC-LAMP+成熟树突状细胞（浅绿色）

PNAd+高内皮小静脉（红色）

3、染色流程：从样本脱蜡、抗原修复，到内源性过氧化物酶封闭、抗体孵育，再到TSA标记与抗体剥离，重复多轮后完成7重标记，最后封片干燥，全程严格控制温度与孵育时间，确保信号稳定。

4、实验结果与图片解析：从可视化到量化验证

这是该研究中最具代表性的结果图，展示了非小细胞肺癌样本中TLS的完整结构。

图a为DAPI核染色（白色），显示细胞分布；图c-h分别显示6种细胞类型的空间分布：

图c：CD20+B细胞（紫色）形成密集聚集区

图d：CD3+T细胞（橙色）围绕在B细胞区周围

图e：pan-Cytokeratins+肿瘤细胞（黄色）位于TLS外围

图f：CD21+滤泡树突状细胞（蓝色）在B细胞区内形成网络

图g：DC-LAMP+成熟树突状细胞（粉色）位于T-B细胞交界区

图h：PNAd+高内皮小静脉（红色）为TLS提供营养支持

图b为6种标记物的叠加图像，清晰展示了TLS的复杂空间组织。这种多色可视化不仅美观，更重要的是为后续的AI分析提供了高质量的数据基础。

三、关键突破：HALO-AI自动化分析流程

若说染色是“基础”，AI分析则是“核心”。研究构建了分层递进的HALO-AI分析体系，所有算法需通过＞85%准确率验证（视觉对比分割结果与原始图像一致性），确保量化结果可靠。

流程分为5大关键步骤：

1.区域标注（ROI）

首先圈定“感兴趣区域”，涵盖肿瘤、间质及TLS区域，同时排除无组织区、坏死灶、红细胞等干扰项——后续分析仅针对ROI进行，减少无关信号影响。

2.组织分割：区分“关键组织类型”

采用MiniNet算法（适合＜100样本的小队列，快速且稳健），将样本分为5类：无组织区（玻璃）、间质、人工伪影（坏死、灰尘等）、TLS、肿瘤。训练时需覆盖样本异质性（如不同TLS成熟度、肿瘤浸润程度），确保算法能精准区分“分散免疫细胞”与“结构化TLS”。

3.细胞核/细胞分割：精准识别单个细胞

基础分割：基于DAPI染色识别圆形细胞核；

特殊细胞优化：针对长形细胞（如HEV细胞）、大型细胞（如肿瘤细胞），额外加入CD21、泛细胞角蛋白等通道辅助分割，避免漏检或误判；

验证标准：需标注＞2000-3000个不同形态细胞核，确保算法覆盖细胞异