酯类合成关键酶的改造与优化.pdfVIP

摘要

相比化学催化，酶催化酯类合成具有反应条件温和、产物选择性强及副产

物少等优势，因此具有（部分）替代化学催化合成酯类的潜力。本研究通过定

向进化和半理性设计提升IsPETase的酰基转移酶活性，使其能够以对苯二甲酸

双羟乙酯（BHET）为底物在水相中常温聚合生成对苯二甲酸双羟乙酯二聚体，对

苯二甲酸双羟乙酯二聚体（BHET-MHET）的产率得到显著提升，为塑料PET寡

聚物的合成提供酶催化剂。随后研究了RgPETase催化2,5-呋喃-二甲酸二甲酯

（FDME）生成聚（己二酸丁二酸二丁酯-2,5-呋喃二羧酸丁二醇酯）（PBAF）

的前体双（4-羟基丁基）呋喃-2,5-二羧酸酯（Bis-BDO酯）的性能，为塑料前体的

合成提供了新的方法。具体内容如下：

首先，为了提升IsPETase的酰基转移酶活性，构建和筛选了随机突变库和关

键位点饱和突变库，结合浑浊度方法筛选有益突变体。结果表明：突变体T1T127D9

对BHET的酰基转移酶活性最高，相比野生型（4.2%），突变体T1T127D9催化生成

BHET-MHET的产率可提升约70%；相比出发菌株IsPETase/T1（57.68%），突变体

T1T127D9催化生成BHET-MHET产率可提升约16%。随后研究了RgPETase转化

FDME生成PBAF的前体Bis-BDO酯，并对反应条件进行了优化，分别是反应pH、

底物兼溶剂BDO的含量、反应温度和酶量。在pH8.0、30%（V/V）1,4丁二醇（1,

4-butanediol，BDO）、30℃条件下，6MRgPETase可催化10mMFDME可产生2.96

mM双（4-羟基丁基）呋喃-2,5-二羧酸酯，表明RgPETase具有较好的酰基转移酶活

性，能通过酰基转移反应有效催化FDME生成PBAF的前体Bis-BDO酯，为生物塑

料PBAF前体的合成提供了一条绿色可持续的途径。

关键词：塑料寡聚物合成；酰基转移反应；定向进化

ABSTRACT

Comparedwithchemicalcatalysis,enzyme-catalyzedestersynthesishasthe

advantagesofmildreactionconditions,strongproductselectivityandfewby-

products,soitispotentialtoreplacechemicalcatalysisinestersynthesis.Inthis

study,directedevolutionandsemirationaldesignwereusedtoimprovethe

acyltransferaseactivityofIsPETase,sothatdihydroxyethylterephthalate(BHET)

couldbepolymerizedinaqueousphaseatroomtemperaturetoform

dihydroxyethylterephthalatedimer.Theyieldofdihydroxyethylterephthalate

dimer(BHET-MHET)wassignificantlyincreased,whichprovidedenzyme

catalystforthesynthesisofplasticPEToligomer.Then,thepropertiesofbis(4-

hydroxybutyl)furan-2-dicarboxylicacidester(Bis-BDOester),th