基于电子顺磁共振技术研究大肠杆菌外膜蛋白BamA的功能性动态构象变化.pdfVIP

临沂大学硕士学位论文

摘要

近年来，抗生素耐药性问题在全球范围内持续加剧，革兰氏阴性菌因其独特的外膜

结构所表现的多重耐药性已成为临床治疗的重大挑战。革兰氏阴性菌的外膜蛋白（OMPs）

在维持细菌外膜结构和功能中起着关键作用，其中β-桶状蛋白组装机器（BAM）是细菌

OMPs组装整合的关键机器，直接影响细菌存活与致病表型，BAM功能受损会破坏OMPs

的正常组装，进而引发细菌死亡。在大肠杆菌中，BAM复合物由BamA-E的五个亚基

组成，其中BamA和BamD是细胞生存不可或缺的核心成分，而BamA/BamD/BamE三

者的协同作用是OMPs生物发生所需的最小功能单元。尽管BAM复合物的基础结构已

有较多报道，但它究竟如何介导OMPs折叠并插入外膜，特别是BAM复合物的动态变

化过程亟待深入探究。基于以上原因，本文采用纯化的BAM成分蛋白来重组含有不同

BAM亚复合物（BamA、BamAD、BamADE）的脂质体，通过定点自旋标记-电子顺磁

共振技术（SDSL-EPR）深入研究BAM最小功能单元中核心蛋白BamA的构象变化，

为探究BAM的作用原理供新的见解。本文的具体内容如下：

（1）首先根据BamA晶体结构和功能特征，在其β-桶状结构域（β2链和β16链）

及胞外区段Loop（Loop3和Loop6）设计突变位点，构建含单/双半胱氨酸（Cys）点突

变的原核表达载体pET22b-Strep-BamA（Cys），转化至BL21（DE3）感受态细胞。经过

诱导表达和纯化等步骤获得BamA（Cys）点突变蛋白，同时完成辅助脂蛋白BamD和

BamE的表达与纯化，为后续实验奠定物质基础。其次，采用离体蛋白转运系统重组技

术成功构建了含有BamA（Cys）点突变蛋白、BamA（Cys）点突变蛋白/BamD复合物

以及BamA（Cys）点突变蛋白/BamD/BamE复合物的脂质体，为后续开展脂质体状态下

的EPR波谱检测奠定基础。

（2）针对包含BamA（Cys）点突变的不同BAM复合物组分的脂质体模型（BamA、

BamAD、BamADE），运用SDSL-EPR技术检测单突变位点的运动性信息和双突变点间

的距离信息，深入研究BAM复合物中核心蛋白BamA的构象变化，来探索其在OMPs

整合中的分子机制。结果显示，BamA利用其β-桶状结构域与胞外Loop区域的构象变

化，实现了底物的有效转运，这一动态过程受到辅助脂蛋白BamD和BamE的精细调

控。

本文通过SDSL-EPR技术解析BamA（Cys）点突变蛋白的构象动态，发现β-桶状

结构域与胞外区段Loop的协同构象变化直接参与底物转运过程，可能通过“侧向开放”

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基于电子顺磁共振技术研究大肠杆菌外膜蛋白BamA的功能性动态构象变化

或“向内开放”机制辅助OMPs整合。在最小功能单元BamADE时，β-链上的两个BamA

（Cys）点突变蛋白间距缩小，同时Loop上的两个BamA（Cys）点突变蛋白间距也缩

小，表明BamD和BamE的协同作用触发底物蛋白的释放和转运。这些发现揭示了BamA

在底物转运过程中的动态特性，另外还强调了BamD/E在调控这一过程中的重要作用，

为革兰氏阴性菌中OMPs的组装机制供了重要的动态结构证据，也为深入了解BamA

的工作机制及其与辅助脂蛋白的相互作用供了新的视角。

关键词：β-桶状外膜蛋白；BamA；SDSL-EPR；运动性；位点间距

II