CN104432358A 一种富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的发酵柚子汁的制作方法 （杭州元佩特生物科技有限公司）.docxVIP

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利申请

(10)申请公布号CN104432358A

(43)申请公布日2015.03.25

(21)申请号201410751127.7

(22)申请日2014.12.10

(71)申请人杭州元佩特生物科技有限公司

地址310052浙江省杭州市滨江区建业路

511号华业大厦7层739室

(72)发明人邓惟莫凡阮子琦张哲滔

(74)专利代理机构杭州天勤知识产权代理有限公司33224

代理人胡红娟

(51)Int.CI.

A23LA23LC12NC12N

2/06(2006.01)1/29(2006.01)15/03(2006.01)

15/01(2006.01)

权利要求书3页说明书14页

(54)发明名称

一种富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的发酵柚子汁的制作方法

(57)摘要

CN104432358A本发明公开了一种富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的发酵柚子汁的制作方法，包括：将产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌10261和10263分别进行亚硝基胍诱变，然后混合二者诱变后代，进行细胞融合传代培养，并在基因组重排技术基础上进一步采用底物诱导适应性策略，高通量筛选得到高产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌；将干酪乳杆菌进行亚硝基胍诱变，从中筛选出甲硫氨酸营养缺陷型的干酪乳杆菌；将筛选出的纳豆芽孢杆菌和干酪乳杆菌共发酵柚子汁，得到富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的柚子汁。本发明得到的富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的柚子汁中，吡咯喹啉醌含量达到56-98ng/mL,纳豆激酶活力

CN104432358A

CN104432358A权利要求书1/3页

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1.一种富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的发酵柚子汁的制作方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)、将产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌10261和纳豆芽孢杆菌10263分别进行亚硝基胍诱变；然后混合二者诱变后代，进行细胞融合传代培养，高通量筛选得到高产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌，命名为纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-517;

2)、将干酪乳杆菌进行亚硝基胍诱变，从中筛选出甲硫氨酸营养缺陷型的干酪乳杆菌，命名为干酪乳杆菌LcS-Met;

3)将纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-517和干酪乳杆菌LcS-Met共发酵柚子汁，得到富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的柚子汁。

2.根据权利要求1所述的富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的发酵柚子汁的制作方法，其特征在于，步骤1)中，所述的高通量筛选具体包括：①制备2个平板豆芽汁柚子汁固体培养基，其中一个将小鼠抗PQQIgG单抗PQQ-mAb配入，形成平板A,另一个将琼脂糖-纤维蛋白配入，形成平板B;②将纳豆芽孢杆菌10261和纳豆芽孢杆菌10263的诱变融合后代涂布其中一个平板后，再用纤维素膜影印至另一个平板，使平板A和平板B互为影印平板；③平板A中，高产吡咯喹啉醌的诱变融合后代菌落周围形成肉眼可见沉淀圈，根据沉淀圈直径大小可肉眼判断产吡咯喹啉醌量大小；④平板B中，高产纳豆激酶的诱变融合后代菌落周围形成透明圈，根据透明圈直径大小可肉眼判断产纳豆激酶活力高低；⑤平板A与平板B中，高产吡咯喹啉醌菌落与高产纳豆激酶菌落处于同一位置者，即为高产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌。

3.根据权利要求2所述的富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的发酵柚子汁的制作方法，其特征在于，步骤1)中，所述的平板豆芽汁柚子汁固体培养基以1L计，由以下量的组分组成：

柚子汁100~150mL;

蔗糖4.0~6.0g;

琼脂1.5~2.0g;

豆芽汁余量。

4.根据权利要求1所述的富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的发酵柚子汁的制作方法，其特征在于，步骤2)中，所述的从中筛选出甲硫氨酸营养缺陷型的干酪乳杆菌，具体包括：①制备2个平板MRS固体培养基，其中一个将甲硫氨酸配入，为平板C,另一个为单纯MRS固体培养基平板，为平板D;②将诱变后的干酪乳杆菌涂布其中一个平板后，再用纤维素膜影印至另一个平板，使平板C和平板D互为影印平板；③在平板C与平板D的同一位置，平板C出现菌落而平板D