CN104432320A 食疗梨汁的制作方法 （杭州元佩特生物科技有限公司）.docxVIP

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利申请

(10)申请公布号CN104432320A

(43)申请公布日2015.03.25

(21)申请号201410749515.1

(22)申请日2014.12.10

(71)申请人杭州元佩特生物科技有限公司

地址310052浙江省杭州市滨江区建业路

511号华业大厦7层739室

(72)发明人张哲滔阮子琦莫凡邓惟吴渊

(74)专利代理机构杭州天勤知识产权代理有限公司33224

代理人胡红娟

(51)Int.CI.

A23LA23L

A23LA23L

2/02(2006.01)

2/60(2006.01)

2/84(2006.01)1/29(2006.01)

权利要求书3页说明书14页

(54)发明名称

食疗梨汁的制作方法

(57)摘要

CN104432320A本发明公开了一种食疗梨汁的制作方法，包括：将产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌10261和10263分别进行亚硝基胍诱变，然后混合二者诱变后代，进行细胞融合传代培养，并在基因组重排技术基础上进一步采用底物诱导适应性策略，高通量筛选得到高产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌；将干酪乳杆菌进行亚硝基胍诱变，从中筛选出甲硫氨酸营养缺陷型的干酪乳杆菌；将筛选出的纳豆芽孢杆菌和干酪乳杆菌共发酵梨汁，得到富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的梨汁。本发明得到的富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的梨汁中，吡咯喹啉醌含量达到70-91ng/mL,纳豆激酶

CN104432320A

CN104432320A权利要求书1/3页

2

1.一种食疗梨汁的制作方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)、将产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌10261和纳豆芽孢杆菌10263分别进行亚硝基胍诱变；然后混合二者诱变后代，进行细胞融合传代培养，高通量筛选得到高产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌，命名为纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-503;

2)、将干酪乳杆菌进行亚硝基胍诱变，从中筛选出甲硫氨酸营养缺陷型的干酪乳杆菌，命名为干酪乳杆菌LcS-Met;

3)将纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-503和干酪乳杆菌LcS-Met共发酵梨汁，得到富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的梨汁。

2.根据权利要求1所述的食疗梨汁的制作方法，其特征在于，步骤1)中，所述的高通量筛选具体包括：①制备2个平板豆芽汁梨汁固体培养基，其中一个将小鼠抗PQQIgG单抗PQQ-mAb配入，形成平板A,另一个将琼脂糖-纤维蛋白配入，形成平板B;②将纳豆芽孢杆菌10261和纳豆芽孢杆菌10263的诱变融合后代涂布其中一个平板后，再用纤维素膜影印至另一个平板，使平板A和平板B互为影印平板；③平板A中，高产吡咯喹啉醌的诱变融合后代菌落周围形成肉眼可见沉淀圈，根据沉淀圈直径大小可肉眼判断产吡咯喹咻醌量大小；④平板B中，高产纳豆激酶的诱变融合后代菌落周围形成透明圈，根据透明圈直径大小可肉眼判断产纳豆激酶活力高低；⑤平板A与平板B中，高产吡咯喹啉醌菌落与高产纳豆激酶菌落处于同一位置者，即为高产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌。

3.根据权利要求2所述的食疗梨汁的制作方法，其特征在于，步骤1)中，所述的平板豆芽汁梨汁固体培养基和斜面豆芽汁梨汁固体培养基以1L计，由以下量的组分组成：

梨汁100~150mL;

蔗糖4.0~6.0g;

琼脂1.5~2.0g;

豆芽汁余量。

4.根据权利要求1所述的食疗梨汁的制作方法，其特征在于，步骤2)中，所述的从中筛选出甲硫氨酸营养缺陷型的干酪乳杆菌，具体包括：①制备2个平板MRS固体培养基，其中一个将甲硫氨酸配入，为平板C,另一个为单纯MRS固体培养基平板，为平板D;②将诱变后的干酪乳杆菌涂布其中一个平板后，再用纤维素膜影印至另一个平板，使平板C和平板D互为影印平板；③在平板C与平板D的同一位置，平板C出现菌落而平板D未出现菌落，或平板C上的菌落显著大于平板D上的菌落，则该菌落为甲硫氨酸营养缺陷型干酪乳杆菌。

5.根据权利要求4所述的食疗梨汁的制作方法，其特征在于，步骤