基因工程实验PPT课件.pptVIP

*基因工程实验实验五引物设计及PCR扩增靶基因PCR引物设计引物决定了PCR产物的长度和特异性。目前有多种引物设计软件，如primerpremier5.Oligo和北京军事医学科学院李伍举教授开发的Biosun等，Internet免费引物设计网站有primer3，Primerfinder等。引物设计有以下几个原则：（1)引物的特异性。引物应根据目的序列进行设计，引物与非靶序列之间不要超过70％的同源性或连续8个的碱基互补，减少非特异产物；（2)引物的长度。一般指引物中能与模板序列互补结合的部分，不包括在5‘端额外增加的酶切位点序列和其他序列。引物长度以18～24bp为佳。（3)引物3’末端的碱基。引物3’末端是延伸的始端，碱基错配会影响延伸效率。当最后一个碱基是A时，容易发生错配，所以引物3’末端最好不要为A；（4)引物的G+C含量一般为40％～60％，过高或过低都不利于引发反应；（5)两条引物不能形成稳定的二聚体，或引物自身不能形成稳定的二级发夹结构，这些都会影响引物与模板的结合。（6)两条引物的融解温度Tm值尽量不要相差太大，引物的Tm值粗略计算公式为Tm=4（G+C)+2（A+T)；（7)引物的5端对扩增特异性没有影响，因此可以被修饰而不影响扩增的特异性，引物5′端修饰包括加酶切位点、标记生物素和荧光等