第十章动物基因工程.ppt

第十章???动物基因工程 现代生物技术（生物工程）的概念 建立在分子遗传学、生物化学、微生物学以及化学工程、计算技术等基础上的现代生物技术，是20世纪后半叶蓬勃发展起来的新技术领域，为人类保健、农牧业、食品工业、环境保护等提供了强大的发展动力。 现代生物技术的内涵非常广泛并不断发展，目前主要有：基因工程 · 细胞工程 · 蛋白质工程· 酶工程 · 糖工程 · 环境生物工程 · 转基因动物 · 克隆动物 · 基因治疗 · 生物制药· 生物信息学 · 高级生物传感器 第一节 基因工程概述 一、重组DNA技术的建立 1972年美国斯坦福大学的Berg获得了SV40和λDNA重组的DNA分子  1973年美国斯坦福大学的Cohen 等人，将大肠杆菌R6-5质粒DNA（含卡那霉素抗性基因）和大肠杆菌pSC101质粒DNA（含四环素素抗性基因）重组后转化大肠杆菌，产生同时表现出两种抗性的细菌。 Cohen与Boyer等合作，将非洲爪蟾编码核糖体的基因同pSC101质粒构成重组DNA分子，并导入大肠杆菌，证实动物基因进入了细菌细胞，并在细菌细胞中增殖和转录产生相应的mRNA。  基因工程的概念 ○基因工程是一种DNA重组技术,在分子水平上进行遗传操作，按设计的蓝图，从供体中提取或人工合成目的基因，令其与载体构建成重组DNA，再转移到受体细胞，目的基因在细胞中表达获得新的遗传性状  ○基因工程的操作程序：获取目的基因——目的基因与载体构建重组DNA分子——重组DNA分子转移至受体细胞——转化细胞的扩增、鉴定和筛选 第二节????工具酶 一、限制性内切酶 （一）分类与命名 ○ 酶有几千种，分为6大类：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、连接酶。 ○ 基因工程中常用作用于核酸的酶，包括水解酶、修饰酶、聚合酶等 水解酶分为内切酶和外切酶 ○ 内切酶在核酸链内部切割，生成寡核苷酸；外切酶从核酸链的末端开始，渐进式地水解核酸链，逐渐释放单核苷酸。 限制性内切核酸酶(restriction enzymes) 能识别双链DNA分子中一段特异的核苷酸序列，在这一段序列内将双链DNA分子切断。 功能：降解外来DNA分子，以限制(restriction )或阻止病毒侵染 是细菌细胞为防御异源遗传物质进入的一种有效方式。 限制性内切酶分类 第Ⅰ类限制性酶：每隔一段DNA序列随机切割双链DNA分子，没有序列特异性 第Ⅱ类限制性酶：能识别一段特异的DNA序列，准确地酶切双链DNA的特异序列 识别的序列是对称的，即在一条链中从5’到3’方向的序列，与其互补链从5’到3’方向的序列完全相同。这种从两个方向阅读而序列相同的序列称为回纹对称序列(palindrome)（EcoRⅠ） 另一类酶，如SmaⅠ，它们酶切DNA双链后，产生的DNA片段具有平齐末端(blunt ends) 限制性酶EcoRI识别位点（粘性末端） EcoRI酶切不同来源的DNA及退火重组 平齐末端（SmaⅠ） 限制性内切酶的命名 限制性内切酶的主要用途 ○ 重组DNA分子 · 匹配末端的连接 同一种酶切割不同DNA分子产生相同的突出末端；或不同酶切割不同DNA分子产生相同的突出末端，可在连接酶作用下连接为重组DNA分子。 · 平端连接 可直接连接，但效率较低。 · 不匹配黏端的连接 先补平(Klenow)或修平(S1)后再连接。 ○ 绘制物理图谱（限制性内切酶图谱） 二、DNA聚合酶 （一）DNA聚合酶的类型 ○ 依赖DNA的——DNA聚合酶Ⅰ、DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow）、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、修饰的T7 DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶。 ○ 不依赖DNA的——末端转移酶 ○ 依赖RNA的——反转录酶 DNA聚合酶的特性 三、DNA连接酶  · 该酶的用途是将带匹配黏端的双链DNA或平端双链DNA片段的5’- P 与另一也带相应缺口的DNA片段的3′ - OH 连接起来 四、甲基化酶、核酸酶等（从略）  第三节????基因工程载体 ○ 载体是指将外源DNA片段运送进宿主细胞进行扩增或表达的运载工具 ○ 克隆载体——克隆了外源DNA后，转入宿主细胞中进行繁殖，使克隆的DNA片段数量大大增加 ○ 表达载体——将外源基因或DNA片段在宿主细胞中表达蛋白质 ○ 插入型载体——将外源基因或DNA插入其中 ○ 置换型载体——切除载体部分DNA，代之以外源基因或DNA。 载体必须具备的条件 · 能在宿主