细菌室操作手册.docVIP

临床细菌检验工作的基本要求和技术 对临床细菌检验人员的要求 负责鉴定及签发报告的主管技术人员应通晓诊断细菌学的全面知识。 一般细菌室工作人员均应具备细菌传染、消毒、灭菌的知识。 通晓细菌室守则，并严格遵守。 负责人应不断更新知识，了解细菌学检验的新进展。 定期或随时与临床医师联系，主动参与临床病例讨论，了解病情及治疗情况，达到细菌检验与临床的密切联系。 工作人员应定期进行健康体检及必要的预防接种，增强自身抵抗能力。 二、工作人员守则 在细菌室工作人员应注意，既不要给室内带来污染，也不要被室内的微生物感染。工作人员必须遵守以下规则： 穿专用的工作衣、帽入室；必要时应戴口罩。 不允许无关人员进入实验室。 室内禁止饮食、吸烟、闲谈等非专业活动。 养成在室内手不触及口、脸、头发及躯体的习惯。 操作中不可说话，以免口中飞沫污染标本。 每次完成工作和离开实验室前，应用肥皂洗手，接触了致病菌类，须用消毒剂消毒手。 个人物品不许带入室内。 当工作环境被细菌培养物污染，必须用适当的强消毒液泼撒覆盖污染物，并报告主管人员采取必要的措施。 工作人员被细菌培养物污染，应用弱或中等消毒剂清洗，必要时应给予药物治疗，并向主管负责人报告，进一步采用特殊措施。 基本染色方法 染色的第一步是制作涂片。菌液涂片时，用接种环沾取菌液点在载玻片上，标本可直接在玻片上涂布。菌落涂片时，先取生理盐水 1滴，置玻片上，用接种针挑取菌落，在盐水中涂布。涂片时必须注意应轻轻操作。猛烈的动作会改变菌细胞原有的排列形式，或造成细菌鞭毛脱落，影响结果的准确性。制备的涂片应自然干燥，并经火焰固定，固定温度不宜过高，以玻片背面接触手背不烫为准，否则可能使细胞形态改变。将固定后的涂片进行染色。 一、革兰染色 本染色是最基本的染色法，可用于标本涂片或菌落涂片。染色结果将细菌分为革兰阳性(紫色)和革兰阴性(红色)两类。 试剂 1. 结晶紫溶液 A液： 结晶紫 2g 95％乙醇 20ml B液： 草酸铵 0.8g 蒸馏水 80ml 需在用前24h将A液、B液混合，过滤后装入试剂瓶内备用。 2．碘液 碘 1g 碘化钾 2g 蒸馏水 300ml 碘与碘化钾混合并研磨，加入几毫升水，使其逐渐溶解，然后研磨，继续加入少量蒸馏水至完全溶解。最后补足水量。 也可用少量蒸馏水，先将碘化钾完全溶解，再加入碘片，待完全溶解后，加水至300ml。 3．脱色液：95％乙醇。 4．复染液 A. 贮存液： 沙黄 2.5g 95％乙醇 100ml B. 应用液： A液 10ml 蒸馏水 90ml 染色方法： 1．涂片经火焰固定，加结晶紫液染1 min，清水冲去染液。 2．加碘液染l min，水洗。 3．加脱色液，不时摇动约10～30s，至无紫色脱落为止，水洗。 4．加复染液，染30s，水洗。 5．干后镜检。 二、抗酸染色 抗酸染色直接用于痰标本时，可以适当增加标本涂片的厚度，以提高检出率。染厚涂片时，须掌握复染色时间。如果背景过深，影响镜检。 奴卡菌及放线菌可呈弱抗酸性，取培养菌落涂片染色时，呈现两种现象，视野中有些菌细胞阳性，另外一些则阴性；有时同一个菌体上，红色的深浅亦有不同，观察时应予注意。 抗酸染色有两种常用方法：① 碱性复红法又称萋纳(Ziehl—Neelsen)法。 ② 荧光染料金胺O法(也称金胺罗丹明法)。 碱性复红染色法 试 剂 1．萋纳石炭酸复红溶液 碱性复红乙醇饱和溶液 10ml 5％石炭酸溶液 90ml 2．脱色剂 * 浓盐酸 3ml 95％乙醇 97ml 3．复染液(吕弗勒美蓝液) 美蓝乙醇饱和溶液 30ml 10％氢氧化钾 0.1ml 蒸馏水 100ml 染色方法 1．涂片经火焰固定，加石炭酸复红溶液，徐徐加热至有蒸汽出现，切不可沸腾。染5 min(若染色奴卡菌需要加长时间)，水洗。 2．加脱色剂，不时摇动玻片至无红色脱落为止，水洗。 3．加复染液，染0.5～l min，水洗。 4．干后镜检。分枝杆菌呈红色，背景为蓝色。 *：奴卡菌、放线菌标本染色时，脱色剂改用2％硫酸水溶液。 (二)金胺O-罗丹明B染色法 染 剂 1．罗丹明B液：罗丹明B 0.1g加蒸馏水100ml； 2．0.1％金胺O液：金胺O 0.1g加蒸馏水95ml，再加入纯石炭酸5ml，混匀； 3．3％盐酸酒精； 4．稀释美蓝液：吕弗勒美蓝液10ml，加蒸馏水90ml，混匀。 方 法 涂片固定后加第1