抗菌肽CP10A在大肠杆菌中的融合表达.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（７）：１０５～１０９ 抗菌肽 ＣＰ１０Ａ在大肠杆菌中的融合表达 １，２ １ １，２ １ １ １ 罗永平 　张惠文 　王小刚 　徐明恺 　苏振成 　张成刚 （１中国科学院沈阳应用生态研究所　沈阳　１１００１６　２中国科学院研究生院　北京　１０００４９） 摘要　ＣＰ１０Ａ是一种由抗菌肽Ｉｎｄｏｌｉｃｉｎｅ经过序列改造，且对多数革兰氏阳性病源细菌具有较强抗 菌活性的多肽序列。研究根据已报道的ＣＰ１０Ａ氨基酸序列，兼顾大肠杆菌密码子偏好性，设计 ＣＰ１０Ａ的核苷酸序列，利用ＰＣＲ技术合成相应的ＤＮＡ序列，后克隆构建重组表达载体ｐＥＴ３２ａ（＋） ＣＰ１０Ａ，转入大肠杆菌ＡＤ４９４菌株。经ＩＰＴＧ诱导表达和１５％ＳＤＳＰＡＧＥ电泳检测后发现产物以包 涵体形式存在，且融合表达量占总蛋白的５０％。在变性条件下经ＮｉＮＴＡ亲合柱层析及复性，最终 获得了较高纯度的可溶性重组蛋白。研究首次实现了ＣＰ１０Ａ抗菌肽在大肠杆菌中的融合表达，为 进一步研究其生物学活性及应用奠定了一定的基础，同时也为研究抗菌肽表达提供了一种方法。 关键词　ＣＰ１０Ａ　克隆　大肠杆菌　表达　纯化 中图分类号　Ｑ７８６ 　　自从１９２９年青霉素的发现以来，抗生素为人类做出 活性。因此分离新型和改造现有抗菌肽以提高其抗菌效 了巨大的贡献，然而随着其使用引发的细菌耐药性问题 能对于其进一步开发利用具有十分重要的意义。直接从 日益严峻，寻找具有新颖作用机制的新型抗微生物药物 生物体中分离或化学合成抗菌肽，其产量有限不利于大 已经成为现代医学和农学关注的焦点。１９７５年瑞典科 量制备和应用。因此有许多学者正在研究探索通过基因 ［１］ 工程手段实现其大量表达。 学家Ｂｏｍａｎ等 从Ｈｙａｔｏｐｈｏｒａｃｅｃｒｏｐｉａ蛹中诱导分离得 到了第一个抗菌肽ＣｅｃｒｏｐｉｎＢ，随后大量的这种小分子 　　抗菌肽Ｉｎｄｏｌｉｃｉｎｅ是一种主要对于革兰氏阳性细菌尤 多肽被分离或人工模拟设计合成。抗菌肽是一类具有免 其是临床耐药菌具有较强杀灭活性，同时也对革兰氏阴性 疫学功能的小分子活性多肽的统称，具有抗细菌、真 细菌和真菌具有一定的抑杀作用的多肽，其杀菌机制主要 ［２］ ［３］ ［４］ ［５］ ［６］ 是引起质膜的通透性但不引起细胞溶解［１１，１２］。ＣＰ１０Ａ是 菌 、病毒 、肿瘤 、内毒素 和原生动物 的作用， 并且具有刺激单核细胞和嗜中性白细胞的趋化、促进创 根据Ｉｎｄｏｌｉｃｉｎｅ人工设计合成的一种具有更强抗菌性的１３ ［７］ ［１３］ 伤愈合 等生物活性。抗菌肽主要产生于昆虫体内，且 肽 ，由于将Ｉｎｄｏｌｉｃｉｎｅ序列中第３、７、１０位的脯氨酸替换 在几乎所有的物种中都被分离到。抗菌肽的结构和作用 为疏水性更强的丙氨酸，其抗菌活性提高了１～３倍，ＭＩＣ 在 ｇ／ｍｌ级，因此显示出了重要的研究价值和应用前景。 机制独特，以两亲性 螺旋或疏水性结构为主，大多通过 μ α 引起质膜的通透性而溶解微生物细胞。因其分子量小、 研究依据ＣＰ１０Ａ对大肠杆菌的抗性相对于革兰氏阳性菌 抗菌谱广、抗菌活性高、无致畸、不易产生抗药性以及对 较弱的特点，同时考虑到直接表达小分子多肽不易检测和 高等生物正常细胞无毒害等优点，抗菌肽具有很高的药 分辨，而且ＣＰ１０Ａ具有高疏水性结构，采用将其与能够增 ［８，９］ 加可溶性表达的硫氧还蛋白融合表达的策略，融合蛋白分 用价值 ，并且一些抗菌肽已经应用于临床或正在临 ［１０］