实验九酵母RNA的提取及组份鉴定与核酸的定量测定.pptVIP

二、实验原理 1.提取制备RNA的方法 2.RNA组分的鉴定 3.紫外吸收测定核酸的浓度 4.离心机的使用及注意事项 1.提取制备RNA的方法 工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。浓盐法使用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3-4h，迅速冷却，提取液经离心后, 上清液用乙醇沉淀RNA。稀碱法使用稀碱使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。 酵母含RNA达2.67-10.0%，而DNA含量仅为0.03-0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。 2.RNA组分的鉴定 （3）磷酸与钼酸铵试剂作用产生黄色的磷钼酸铵[(NH4)3PO4·12MoO3↓]。在定磷试剂中，钼酸铵以钼酸的形式与样品中的磷酸反应生成磷钼酸，当有还原剂存在时磷钼酸立即转变成蓝色的还原产物－钼酸。 三、实验设计方案 （加入NaOH溶液中，研匀，加热以加速反应进行 ） 3000r,15min 第一次： 取上清液 3000r,3min 第二次： 取沉淀 洗涤沉淀3次 布氏漏斗，抽滤 上清液（核酸) 沉淀 乙醇 杂质 核酸 三、实验设计方案 4.1 实验试剂 1、0.04M NaOH溶液； 2、95%乙醇；1.5M硫酸； 3、浓氨水； 4、0.1M硝酸银； 5、酸性乙醇溶液：30mL乙醇加0.3mL HCl； 6、三氯化铁浓盐溶液：将2mL 10％三氯化铁 （FeCl3· 6H2O）溶液加入400mL浓HCl； 7、苔黑酚(3,5-二羟基甲苯)乙醇溶液：称取6g苔黑酚溶于95％乙醇100mL。 8、钼酸铵－过氯酸沉淀剂：取3.6mL 70%过氯酸和 0.25g钼酸铵溶于96.4mL蒸馏水中，即成0.25%钼酸铵－2.5%过氯酸溶液。 4.1 实验试剂 8、定磷试剂： （1） 17％硫酸：将17mL浓硫酸（比重1084）缓缓倾入83mL水中； （2）2.5％鉬酸铵：2.5g鉬酸铵溶于100mL水中； （3）10％抗坏血酸溶液：10g抗坏血酸溶于100mL 水，棕色并保存溶液； 临用时将三种溶液和水按下列比例混合：17％硫酸：2.5％鉬酸铵：10％抗坏血酸：水＝1：1：1：2（V/V）。 9、5-6%氨水：用25-30%氨水稀释5倍。 10 、干酵母粉。 4.2 实验器材 乳钵（研钵）； 150ml锥形瓶； 水浴锅； 量筒； 布氏漏斗及抽滤瓶； 吸管； 滴管； 移液管； 试管及试管架； 烧杯； 漏斗； 离心管； 离心机； 分光光度计。 4.3 离心机的使用及注意事项 4.3 离心机的使用及注意事项 1.离心机使用之前预热几分钟。离心管中加入待离心的物质不能超过总体积的2/3； 2.每一对离心管（包含其待离心的物质）的重量要相等，故在使用离心机之前要在天平上称量。 3.放入离心机时，要注意每对离心管要对称放置。 4.离心机转数为零时，才能打开机盖。 5.离心机的盖子要盖稳，以防离心液溢出。 4.3 离心机的使用及注意事项 5.1 RNA的提取 称9g干酵母粉悬浮于54mL 0.04M NaOH溶液中并在研钵中研磨均匀。悬浮液转入三角烧瓶，沸水浴加热30min，冷却，转入离心管。 3000转/分，离心15分钟后，将上清慢慢倾入