串联亲和纯化技术及其应用.pdfVIP

细胞生物学杂志 Chinese Journal of Cell Biology 2006, 28: 694-698 串联亲和纯化技术及其应用 洪奇华　陈安国* (浙江大学动物科学学院，杭州 310029) 摘要　　串联亲和纯化(tandem affinity purification，TAP)是一种能快速研究体内蛋白质相互 作用的新技术，经过两步特异性亲和纯化，可快速得到生理条件下与靶蛋白质存在真实相互作用 的蛋白质。TAP方法最初用于酵母中，因其具通用性、高效性、高纯度及假阳性低等特点得到了 快速发展，至今已成功运用于许多其他生物。现主要介绍TAP方法的原理、TAP标签及其在不同 物种中的应用。 关键词　　蛋白质相互作用；串联亲和纯化；标签；应用 细胞内蛋白质间相互作用的分析是蛋白质组学 1.1 标签与靶蛋白质融合TAP 研究的一个重要内容。近年发展起来的高分辨率质 [1] 最初由Rigaut等 设计的TAP标签主要由金黄 谱技术为蛋白质复合体的鉴定提供了有力工具，因 色葡萄球菌蛋白A的两个IgG结合域(ProtA)和一个 此确定蛋白质复合体的限制因素不是蛋白质鉴定， 钙调蛋白结合肽 构 而是蛋白质复合体纯化。寻求一种快速、方法可信 成，中间被一个 蛋白酶的 和标准的蛋白质复合体纯化方法非常重要。 酶切位点隔开。应保证靶蛋白质和TAP标签融合后 用传统方法(如亲和层析或免疫共沉淀)难以得 正确表达。 到接近天然状态的蛋白质复合体，尤其是细胞中存 1.2得到稳定表达的细胞或组织 在的一些低丰度蛋白质复合体(它们可能在生命过程 将编码蛋白质标记的基因直接导入内源性编码 [1] 中起重要的调节作用)。Rigaut等 首先提出了一种 靶蛋白基因的特定部位进行原位表达，或将融合基 研究蛋白质相互作用的新方法——串联亲和纯化 因构建在合适的表达质粒中后导人细胞或生物体 (tandem affinity purification, TAP)技术，特别适用于 内。最终使融合TAP标签的靶蛋白表达量维持或接 研究蛋白质在生理条件下的相互作用。该技术通过 近天然表达水平。 在靶蛋白质一端嵌入一个特殊的蛋白质标签(TAP1.3细胞抽提物的准备 tag)，不破坏靶蛋白质调控序列，且靶蛋白质表达 可用各种准备细胞抽提物的策略，应尽可能不 量与体内水平相当；经过两步连续的亲和纯化获得 破坏天然存在的相互作用。 接近自然条件的特定蛋白质复合体，后用质谱技术 1.4 (TAP图1) 或Edman降解法进行蛋白质鉴定。与传统的研究蛋 将细胞抽提物加入IgG亲和柱，复合物中的靶 白质相互作用的技术相比，TAP技术具有周期短、 蛋白通过ProtA标签与亲和柱上的IgG紧密结合，洗 [1,2] 假阳性结果少等优点 。TAP技术最初用于酵母， 去杂蛋白质后再用TEV蛋白酶切割标签，然后将洗 近年来得到了快速发展，至今已成功运用于细菌、 脱下来的带CBP标签的蛋白质复合体与偶联有钙调 病毒、昆虫、植物和哺乳动物等物种。本文就TAP 蛋白的亲和柱混合，在钙离子存在下，CBP就会与 方法的原理、TAP标签及其在不同物种中的应用作 钙调蛋白紧密结合，最后用含有EGTA的比较温和 一介绍。 的洗脱条件洗脱，即可得到高纯度的天然构象的靶 蛋白复合物。两个亲和纯化步骤可互换，但互换后 1 技术的原理和方法TAP 会有TEV蛋