WB中常见问题和解决方法.pdfVIP

1．电泳中常出现的一些现象： ●︶ 条带呈笑脸状 原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好; 电泳系统温度偏高。 ●︵ 条带呈皱眉状 原因：可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。 ●拖尾 原因：样品溶解不好。 ●纹理（纵向条纹） 原因：样品中含有不溶性颗粒。 ●条带偏斜 原因：电极不平衡或者加样位置偏斜。 ●条带两边扩散 原因：加样量过多。 2．Westernblot结果中背景较高 可能的原因及建议： ●膜封闭不够 延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。 ●一抗稀释度不适宜 对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。 ●一抗孵育的温度偏高 建议4℃结合过夜。 ●选择的膜容易产生高背景 一般硝酸纤维素膜的背景会比PVDF膜低。 ●膜在实验过程中干过 实验过程中要注意保持膜的湿润。 ●检测时曝光时间过长 减少曝光时间。 3．Westernblot结果中杂带较多 可能的原因及建议： ●目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带。 查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。 ●目的蛋白有其它剪切本 查阅文献或生物信息学分析可能性。 ●样本处理过程中目的蛋白发生降解 加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。 ●上样量过高，太敏感 适当减少上样量。 ●一抗特异性不高 重新选择或制备高特异性的抗体。 ●一抗不纯 纯化抗体 ●一抗或者二抗浓度偏高 降低抗体浓度。 4.Westernblot结果中无信号或显示信号弱 可能的原因及建议： ●检测样本不表达目的蛋白 选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性。 ●检测样本低表达目的蛋白 提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。 ●转移不完全或过转移 可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间 和电流。 ●抗体不能识别测试种属的相关蛋白 购买抗体前应当认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。 ●一抗孵育时间不足 建议4℃结合过夜。 ●二抗与一抗不匹配 选择针对一抗来源的种属的抗体。 ●洗膜过度 洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用0.1%的弱去垢剂Tween-20。 5.其它现象： ●膜上多处出现黑点或黑斑 原因：抗体与封闭试剂发生非特异性的结合。 ●反白（条带显白色） 原因：目的蛋白含量太高或者一抗浓度偏高。 ●蛋白分子量偏低或偏高 原因：胶浓度不适合，高分子量要用低浓度胶；小分子蛋白要用高浓度胶。 6．安全问题： 操作有毒试剂时，带手套和口罩，且操作挥发性试剂应在通风橱中进行。