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分子生物学 第五章 分之生物学研究方法 重组DNA技术-基因工程 （四）表达载体(expressing vector) 特点：带表达构件—转录和翻译所需的DNA序列 大肠杆菌表达载体：含启动子、核糖体结合位点、克隆位点、转录终止信号 启动子：trp-lac(tac)启动子、λ噬菌体PL启动子、T7噬菌体启动子 核糖体结合位点(ribosome-binding site,RBS)：起始密码子(ATG)和SD序列 转录终止序列 基因克隆示意图 第三节 分子杂交的基本方法 Southern 杂交(Southern bloting)的主要步骤: 1、待测DNA样品的制备、酶切 2、待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 3、凝胶中DNA的变性：碱变性 4、 DNA转印至NC膜 ,烘烤固定DNA 5、预杂交 6、探针杂交 7、冲洗，除去多余的探针 8、放射自显影或显色反应 9、结果分析 缺口平移法（nick translation） 用[α-32P] 标记的dNTP取代原来DNA链中不带同位素的同种核苷酸，生成的两条链均被同位素标记。 1、DNA酶I切割产生切口（低浓度） 2、DNA聚合酶I：5‘-3’的外切活性切除片断5’端的核苷酸，同时在上一个片断的 3’端加入核苷酸，两者同时进行，使切口沿DNA链移动，不断将标记的核苷酸掺入到DNA中，两条链均被标记。 四种dNTP中的一种被标记 人工合成的6~8个核苷酸长的各种不同排列顺序的混合物，它们可以随机地互补到DNA探针的某一处，作为引物，在Klenow片段作用下，合成与探针DNA互补的DNA链，当在反应液中加入[α-32P]dATP时，即可形成放射性同位素标记的DNA探针，但探针DNA序列是长短不等的。 用T4多核苷酸激酶标记DNA5ˊ末端 5ˊ-pCpGpApCpG-3ˊ 碱性磷酸酶(AKP） 5ˊ-HOCpGpApCpG-3ˊ [γ-32P]ATP T4噬菌体多核苷酸激酶（PNK） 5ˊ-32PCpGpApCpG-3ˊ Klenow片段快速标记DNA探针末端 3′—CTTAAG—5′ 5′—GAATTC—3′ EcoRⅠ 5′——G AATTC——3′ 3′——CTTAA G——5′ Klenow, dNTP，[α-32P]dATP 5ˊ——GAATT AATTC——3ˊ 3ˊ——CTTAA TTAAG——5 β-半乳糖苷酶N端的序列 只有两个cos 之间的外源片断35-45bp时，才被包装。其余的片断将不被包装。 酶切位点在四环素基因内酶切后将其破坏。 重组的质粒只有Amp抗性，而无tet抗性 基因文库（gene library):用DNA重组技术将某种生物的总DNA用特定的限制性内切酶切割成一个个片段，然后将这些片段随机地连接在某些质粒或其他载体上，再将它们转移到适当的宿主细胞中，通过细胞的增殖而构成各个片段的无性繁殖系（克隆），当这些克隆多到可以包括该种生物的全部基因时，这一批克隆的总体就称为该种生物的基因文库。 基因文库构建 cDNA文库 提取出组织细胞的全部mRNA，在体外反转录成cDNA，与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。 相同得酶切割目的基因和载体，产生粘性末端，粘性末端互补配对，二者连在一起，在通过DNA连接酶修复修复缺口。 T4DNA连接酶在DNA浓度很高时，可以连接平头末端的双链DNA。 利用T4 连接酶在目的基因两端连接上一段含有某种某种内切酶切割序列的短DNA片断，然后用该种内切酶目的基因和载体，产生粘性末端，进行连接。 重组时将目的基因插入到质粒的抗四环素基因内将其破坏，重组质粒只有氨苄青霉素抗性，而对四环素敏感。而非重组质粒有两种抗性。 1、被转化的细胞由于带有质粒，具有青霉素抗性，因此，在含有青霉素的培养基上能生长形成菌落，而没有转化的细胞则不能生长。 2、在生长的菌落中带有重组质粒的菌落对四环素敏感，而不带有重组质粒的菌落则对四环素具抗性。 3、因此，不能在四环素培养基上生长的菌落带有目的基因。 PUC18 带有编码β-半乳糖苷酶N端的序列（α肽），而缺陷宿主菌则不含该序列，两者互补能形成正常的酶,两者互补形成有功能酶。在IPTG和X-gal(5- 溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)存在时，菌落成蓝色。 重组时,将外源基因插入到α肽序列内将其破坏,转入缺陷 宿主菌后,不能形成有功能的 β-半乳糖苷酶,菌落成白色。 重组质粒用相应的