微生物学实验 环境样品中中细菌总数的测定.pptVIP

模块一 实验三 环境样品中细菌总数的测定 一 实验目的 了解稀释平板计数的原理，掌握涂布平板培养法和混合平板培养法的操作技术。通过土壤中细菌总数的测定，了解微生物数量的测定方法，掌握平板菌落计数的原理和方法. 实验原理 稀释平板计数是根据微生物在高度稀释条件下固体培养基上所形成的单个菌落是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。计数时，首先将待测样品制成均匀的系列稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使成单个细胞存在（否则一个菌落就不只是代表一个细胞），再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。此法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数，故又称活菌计数。一般用于某些产品检定（如根瘤菌剂等）、生物制品检验、土壤含菌量测定及食品、水源的污染程度的检验。 三 实验器材 1 菌种：大肠杆菌、葡萄球菌、产气杆菌混合样品。 2 培养基：牛肉膏蛋白陈琼脂培养基。 3 器材： 90mL无菌水、 gmL无菌水、无菌平皿、 lmL无菌吸管、天平、称样瓶、记号笔、玻璃涂布棒。 四 实验方法 1 样品稀释液的制备 准确称取待测样品10g，放入装有90mL无菌水并放有小玻璃珠的250mL三角瓶中，置摇床上振荡20min，使微生物细胞分散，静置20～30s，即成10-1稀释液；再用 lmL无菌吸管，吸取10-1稀释液lmL。移入装有9mL无菌水的试管中。振荡，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液lmL，移入装有9mL无菌水的试管中，振荡，即成10-3稀释液；以此类推，连续稀释、制成 10-4、 10-5、 10-6、10-7、 10-8、10-9等一系列稀释菌液。 用稀释平板计数时，待测菌稀释度的选择应根据样品确定，样品中所含待测菌的数量多时，稀释度应高，反之则低。通常测定细菌菌剂含菌数时，采用10-7、10-8、10-9烯释度，测定土壤细菌数量时，采用10-4、10-5、10-6稀释度，测定放线菌数量时，采用10-3、10-4、10-5稀释度，测定真菌数量时，采用 10-2、 10-3、 10-4稀释度。 2 平板接种培养 平板接神培养有混合平板培养法和涂抹平板培养法两种方法。 l）混合平板培养法 将无菌平板编上 10-7、 10-8、 10-9号码，每一梯度设置三个重复，用无菌吸管按无菌操作要求吸取1×10-9稀释液各1ml放入编号10-9的3个平板中，同法吸取 10-8稀释液各1mL放入编号1×10-8的3个平板中，再吸取 1×10-7稀释液各 lmL放入编号1×10-7的 3个平板中（由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换）。然后在 9个平板中分别倒入已熔化并冷却至45-50℃的细菌培养基，轻轻转动平板，使菌液与培养基混合均匀，冷疑后倒置。在30℃下培养。至菌落长出后即可计数。 2）涂布平板计数法 涂布平板计数法与混合法基本相同，所不同的是先将培养基溶化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后编号，然后用无菌吸管吸取0．lmL菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上（每个编号设三个重复）。再用无菌涂布棒将菌液在平板上涂布均匀，每个稀释度用一个灭菌涂布棒；更换稀释度时需将涂布棒灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度涂布时，也可以不更换涂布棒。将涂布好的平板平放于桌上20～30min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转。恒温培养，至菌落长出后即可计数。 五 注意事项 倒平板时要注意控制培养基的温度。 稀释操作时，要尽量减少样品稀释误差，而且每个稀释度的菌液应各用一支无菌吸管。 为使菌落能在平板上均匀分布，样品液加入平皿后，应尽快倾注培养基并旋转混匀。 六 思考题 要测定某种液体饮料中的活细菌总数，除了采用平板菌落计数法外，还可采用哪些方法？ * *