稳定表达人巨细胞病毒pUL23蛋白的U373细胞系的建立.docVIP

  稳定表达人巨细胞病毒 pUL23 蛋白的 U373 细胞系的建立 刘明亮，李婧惠，冉艳红** 5 10 （暨南大学生命科学技术学院，广州 510632） 摘要：为构建稳定表达 HCMV UL23 基因的人神经胶质瘤细胞 U373 细胞系，本研究采用 PCR 方 法 扩 增 UL23 基 因 ， 将 其 克 隆 到 逆 转 录 病 毒 载 体 pLEGFP-N1 中 ， 构 建 重 组 质 粒 pLEGFP-N1-UL23-Flag。用脂质体法将重组质粒转染至 U373 细胞中，通过细胞内同源重组使 目的基因整合至宿主细胞染色体上，然后用 G418 对细胞进行加压筛选、纯化，进而获得稳 定表达 pUL23 蛋白的 U373 细胞系。用 RT-PCR 和 Western blot，以及荧光显微镜观察等方 法，检测 pUL23 蛋白的表达。结果表明筛选所得的 U373-UL23 细胞系可以稳定表达 pUL23。 成功构建了稳定表达 UL23 基因的细胞系，为 PUL23 功能的进一步研究提供了平台。 关键词：人巨细胞病毒；UL23 基因；U373；G418 中图分类号：Q74 15 Establishment of U373 cell line stably expressing UL23 gene LIU Mingliang, LI Jinghui, RAN Yanhong (College of Life Science and Technology, Jinan University, GuangZhou 510632) Abstract: To establish a Human glioma cell line for stable expression of UL23 gene of HCMV. 20 25 UL23 gene was amplified by PCR and cloned into retroviral vector pLEGFP-N1 to constructed recombinant plasmid pLEGFP-N1-UL23-Flag in this study. U373 cells were transfected with the constructed recombinant plasmid，and the target gene was integrated into chromosome of U373 cells by homologous recombination in vivo. U373 cell lines for stable expression of UL23 gene was screened by continuous G418 pressure screening and purifying. The expression of pUL23 was determined by RT-PCR , Western bloting and observing by fluorescence microscopy. The results show that all of the U373-UL23 cell lines we got can stable express pUL23 . Constructing cell lines stably expressing the UL23 gene successfully, provides a platform for further study of the function of pUL23. Keywords: HCMV; UL23; U373; G418 30 0 引言 人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）是疱疹病毒科 β 亚科中基因组最大的 DNA 病毒，其基因组为 235-kb，所编码的蛋白质超过 200 种，具有种属特异性 【1】 。在发达 国家人群感染率为 40%～60%，而在发展中国家几乎达到 100% 【2】 。在某些条件下，体内潜 35 40 伏的 HCMV 可激活，可造成机体急性或慢性损害，而对于免疫功能低下者可导致视网膜炎、 肺炎、脑炎等严重甚至危及生命的疾病。因此，近年来对 HCMV 病毒自身复制机制及其治 疗方法等进行了大量的研究。 人巨细胞病毒（HCMV）UL23 基因全长为 855bp，属于 HCMV US22 基因家族成员。 之前研究表明 US22 家族成员广泛参与病毒的生长过程，比如 UL36 能通过抑制由 【3】 【4】 等等。 正常情况下,当病毒基因被敲除后，病毒会呈现不生长、生长缓慢或者不受影响