明胶酶谱技术课件.pptVIP

明胶酶，明胶酶包括72 kDa的明胶酶A（MMP-2）和92 kDa的明胶酶B (MMP-9),其作用底物主要是Ⅳ型胶原和明胶，还可降解Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ型胶原,但不能降解间质胶原； MMP-2和MMP-9活性的强弱与肿瘤浸润和转移的能力密切相关； 所以在体外通过酶谱法（Zymography）检测样品（组织，细胞培养液，血清，血浆，尿）中MMP-2和MMP-9的活性，对了解肿瘤细胞的恶性程度、监测治疗效果和评价预后具有重要的指导意义。 （1）玻璃板对齐后放入夹中，垂直卡紧，加满水检漏。 （2）配10%分离胶，APS和TEMED作用为促凝，最后灌胶前加。若板不漏水，则将水倒出，并用吸水纸洗净后灌胶，灌至大约3/4处，上面加满水压平。 （3）配浓缩胶，同样APS和TEMED最后加，分离胶灌入约30min后观察小烧杯中剩余分离胶是否已凝，同时仔细观察可见玻板水和胶间有一条折线，说明胶已凝固。 （4）将上面的水倒去，吸水纸洗净，灌入浓缩胶，灌满，注意一定不要有气泡，然后将梳子插入，注意保持水平，约30min后凝固可用。 明胶酶谱技术 基本原理 先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺（SDS，含0.1％明胶）电泳分离; 然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶; 最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。 复性原理 在电泳过程中，SDS与样品中的MMPs结合（当然是可逆性结合），破坏其氢键、疏水键而使MMPs不能发挥其分解明胶的作用，而只有当将胶置Trition中洗脱（最好是放在摇床上摇，30min／次，做2次或15min/次，4次。静置于Trition中是不妥的。）时，由于SDS被Trition结合而去除，从而使MMPs恢复了活性。 检测类型-MMP2、MMP9 Pre: 信号肽序列 Pro: 带巯基的前肽 Zn: Zn离子结合部分 II: 能结合胶原的II型纤维结合素结构域 H: 绞链区 Hemopexin：类血红素蛋白结构，由四段重复序列组成，其中第一个与第四个间存在一 个二硫键? MMP2的结构 MMP-9的结构 由三个α螺旋与5个β折叠构成 含有2个锌离子和5个钙离子 右图可见一个小分子化合物位于酶活性中心，并与一个 锌离子结合 MMPs 其他类型 间质胶原酶，包括MMP-1、MMP-5、MMP-8、MMP-13，其作用底物主要为间质胶原, 即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅶ、Ⅹ型胶原, 但不能降解明胶和Ⅳ型胶原； 间充质溶解素，包括MMP-3、MMP-7、MMP-10和MMP-11，其作用底物主要是基质中的蛋白多糖和糖蛋白，如纤维粘连蛋白(FN)、层粘连蛋白(LN)，间充质溶解素对胶原的作用不同于间质胶原酶和明胶酶，它们能降解Ⅳ、Ⅴ、Ⅷ、Ⅹ型胶原酶以及Ⅰ型胶原的氨基端。 常用的电泳技术（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳） ?不同分子量的蛋白质在凝胶中运动示意图 不同聚丙烯酰胺凝胶浓度对不同分子量的 蛋白质混合物分离能力的关系 5％ 10％ 15％ 29 45 66 97 200 29 45 66 97 200 29 45 66 97 200 实验操作 血清、血浆和尿样品可取适量直接与2×SDS 样品缓冲液等体积混匀进行下一步实验，如酶活性太高造成显带不理想，可适当进行稀释。 收取细胞上清： (1)取对数生长期的细胞在的无血清培养基中培养24h。 (2)次日收集上清液，移入离心管中 2000rpm 离心10min，-70℃储存备用。 (3)根据细胞计数调整各组细胞培养上清液中的蛋白浓度（或者测定蛋白浓度调整使所上蛋白总量一致）。与2×上样缓冲液混合（不需要煮沸，勿用枪用力吹打，防止出现过多气泡） 一、样品准备 二、凝胶的制备 10 5 TEMED 15 20 10%过硫酸铵 10 25 10%SDS 300 1250 30%丙烯酰胺 600 750 Tris 1500(H2O) 1000 (0.1%明胶) 明胶（H2O） 上（ul） 下（ul） 三、加样及电泳 根据表达强度和蛋白浓度确定上样量 拔掉梳子放入电泳槽，电泳缓冲液只需加至电泳槽的一半，加样孔用小针筒冲洗干净再上样，注意上样时勿使样品逸至邻孔，样品混匀时要轻，不要产生气泡，否则加样时易导致逸出而使结果不准确。剩余未加样孔补加上样液（使条带跑齐），用20ul的加样枪把所有孔补满电泳液，再倒入全部电泳槽的电泳缓冲液 4℃进行SDS电泳100v约1.5小时（电泳时在周围敷上冰，有利于使条带跑直） 四、凝胶的处理 （1）电泳结束后