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DNA测序原理与方法 DNA测序：是对DNA?分子的一级结构的分析。其基本原理是DNA?的复制反应体系中需要存在DNA?聚合酶、DNA?模板、寡核苷酸引物和dNTP，引物和模板退火形成双链后，DNA?聚合酶在引物的引导下在模板链上沿3’→5’的方向移动，dNTP?按照碱基配对原则，逐个连接在引物的3’-OH?末端。 双脱氧链终止法测序 化学降解法测序 自动化测序 基因芯片测序 双脱氧链终止法测序(the chain termination method) 基本原理： 通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链，由于合成的互补链可在不同位置随机终止反应，产生只差一个核苷酸的DNA分子，从而来读取待测DNA分子的顺序。 用于终止反应的双脱氧核苷酸： 将2’ ，3’ –双脱氧核苷酸（ddNTP）参入到新合成的DNA链中，由于参入的ddNTP缺乏3’ –羟基，因此不能与下一位核苷酸反应形成磷酸二酯键，DNA合成反应将中止。 Maxam-Gilbert 化学降解法测序 基本原理： 将一个 DNA 片段的 5 端磷酸基作放射性标记，再分别采用不同的化学方法修饰和裂解特定碱基，从而产生一系列长度不一而 5 端被标记的 DNA 片段，这些以特定碱基结尾的片段群通过凝胶电泳分离，再经放射线自显影，确定各片段末端碱基，从而得出目的 DNA 的碱基序列。 硫酸二甲酯[dimethyl sulphate ，DMS ，（CH3O）2SO2]是一种碱性化学试剂，可以使 DNA 链上的腺嘌呤 A 的 N2 和鸟嘌呤 G 的 N７ 甲基化，但是鸟嘌呤 G 的 N７ 甲基化速度比腺嘌呤 A 的 N2 甲基化速度要快 4-10 倍，并且在中性 pH 环境中， DMS 主要作用于鸟嘌呤 G ，使之甲基化，导致糖苷键断裂。 哌啶甲酸可以使 DNA 链上的嘌呤在酸的作用下发生糖苷水解，导致 DNA 链在脱嘌呤位点（G和A）发生断裂。 肼，又称联氨 NH2.NH2 ，在碱性环境中作用于胞嘧啶 C 和胸腺嘧啶 T 的 C4 和 C6 位置，导致糖苷键断裂。如果加入高浓度的盐（1.2M NaOH），肼则主要作用于胞嘧啶 C ，使之断裂。作为标记用的放射性同位素主要有 γ-32Ｐ（[γ-32Ｐ]ATP，[γ-32Ｐ]GTP. [γ-32Ｐ]TTP ，或[γ-32Ｐ]CTP）。 Maxam-Gilber法所能测定的长度要比Sanger法短一些，它对放射性标记末端 250个核苷酸以内的DNA序列效果最佳。Sanger 法需要单链模板和特异寡核苷酸，并需获得大肠杆菌DNA 聚合酶IKlenow 片段的高质量酶制剂，而Maxam-Gilbert法只需简单化学试剂。 随着M13 噬菌体和噬菌粒载体的发展，也由于现成的合成引物唾手可得及测序反应日臻完善，双脱氧链终止法如今远比Maxam-Gilbert法应用得广泛。 然而，化学降解较之链终止法具有一个明显的优点：所测序列来自原DNA 分子而不是酶促合成所产生的拷贝。因此，利用Maxam-Gilbert法可对合成的寡核苷酸进行测序，可以分析诸如甲基化等DNA 修饰的情况。 由于Sanger法既简便又快速，因此是现今的最佳选择方案。事实上，目前大多数测序策略都是为Sanger法而设计的。 自动化测序 芯片测序 原理：杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法。在一块基片表面固定了已知序列的八核苷酸的探针，当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。 * * 基本原理： 与链终止法测序原理相同,只是用不同的荧光色彩标记ddNTP,如ddATP标记红色荧光, ddTTP标记绿色荧光,ddCTP标记蓝色荧光, ddGTP标记黄色荧光,.由于每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色,而简化为由1个泳道同时判读4种碱基.