信号肽在基因工程的应用.pptVIP

信号肽： 常指新合成多肽链中用于指导蛋白质的跨膜转移（定位）的N-末端的氨基酸序列。（有时不一定在N-末端） 信号肽位于分泌蛋白的N端。一般由15～30个氨基酸组成。包括三个区：一个带正电 的N末端，称为碱性氨基末端：一个中间疏水序列．以中性氨基酸为主，能够形成一段d螺旋结构，它是信号肽的主要功能区；一个较长的带负电荷的C末端，含小分子氨基酸，是信号序列切割位点．也称加工区。 信号肽的结构特点 　　前端（Ns端）：介于-1～+5之间，均带正电荷的碱性aa残基作用：可能和信号肽序列受体（SSR）结合有关。　　中部(Hs区域) ：12～14个aa残基组成疏水片段Met .Leu.Phe。作用： 1）高度疏水，倾向于α—螺旋。有利于与脂质双层作用，促进新生肽链过膜。2）Hs与信号序列识别颗粒（SRP）结合有关(SPR将新生肽链核糖体和RER膜靠近)　　后端（Cs1,Cs2）：富含A/a，易形成β—折叠，有利于肽链断裂。作用：是位于RER膜上的信号肽酶复合物（SPC）水解部位，切除信号肽，使新生肽链也能进入RER。 注意： 1）信号肽的疏水片段较重要，因为如果利用点突变将其中心的疏水aa换成亲水aa，信号肽的功能丧失。 2）信号肽不一定位于分泌蛋白的N端。例如：真核细胞的卵清蛋白N端26～45个aa可能具有信号肽作用，这样的信号肽称为内含信号肽。3）有些比较复杂的膜蛋白（如视蛋白Opsin）可以含有一个以上的信号肽，这些信号肽不一定会被水解 。 新型毕赤酵母分泌表达载体的构建与功能验证 BglⅡ酶切构建好的2 种新型毕赤酵母表达载体 pGAPHα-xyn2和 pGAPHI-xyn2，使质粒线性化，电击法转化毕赤酵母 GS115 ，筛选转化子。在 培养基中震荡培养48 h ，离心取上上 清液，测定木聚糖酶活性，以毕赤酵母诱导型表达载体pPIC9-xyn2为对照，实验结果如表： 融合gp67 信号肽的慈菇蛋白酶抑制剂基因在蚕体内表达 1.重组转移载体 pBacPAK-gpAPI2 的构建 2. 3.血淋巴中表达产物含量的测定 表达产物经 SDS电泳 ,脱色后用凝胶干燥仪干燥 ,用Bio-Rad GS-670 图像分析仪进行扫描处理。测得 CrBK-API4 感染的血淋巴上清液中表达的 API占可溶性蛋白含量的 9 %,CrBK-gpAPI2 感染的血淋巴上清液中表达的 API占可溶性蛋白含量的 7 %。血淋巴中可溶性蛋白总量测定表明:CrBK-API4 感染的血淋巴上清液中为 40mg/ mL ,CrBK-gpAPI2 感染的血淋巴上清液中为 55mg/ mL。从而得到血淋巴中表达的慈菇蛋白酶抑制剂的绝对含量:CrBK-API4 感染的血淋巴中为 3.6mg/ mL ,CrBK-gpAPI2 感染的血淋巴中为3.8mg/ mL。两者的绝对表达量差别不大。 4 .　表达的慈菇蛋白酶抑制剂的活性测定 水稻条纹病毒CP与叶绿体 Rubisco SSU 引导肽融合 基因的构建及其原核表达 方法 1.叶片总 RNA 的提取 2. PCR 扩增 Rubisco SSU和 RSV CP 基因 3. pMD-R 和 pMD- CP 克隆载体的构建 4. pGEX- PR 和 pET- PR-S 表达载体的构建 5. PR- CP 和 PR- S-CP 融合基因的构建 6.融合基因在大肠杆菌中的表达 7.表达产物的 Western blot 鉴定 参考资料： 融合gp67 信号肽的慈菇蛋白酶抑制剂基因在蚕体内表达。 季 平,肖庆利 ,何家禄 ,吕鸿声,吴祥甫 水稻条纹病毒 CP 与叶绿体 Rubisco SSU引导肽融合基因的构建及其原核表达 鹿连明， 林丽明， 谢荔岩， 林奇英， 吴祖建 谢联辉 新型毕赤酵母分泌表达载体的构建与功能验证 宋庆凤，暴立娟，李 杰 * * 信号肽在基因工程的应用 主讲人：钟鸣 成员：黄玲 信号肽分泌蛋白的转运过程 分泌型表达载体 信号肽 ATG 信号序列 插入位点 终止子 分泌型表达载体——原核 原核常用的信号肽： 碱性磷酸酶的信号肽和蛋白质A的信号肽 pTA1529phoA (碱性磷酸酶) pINⅢ系统 ompa（外膜蛋白) PEZZ18蛋白A pTA1529 大肠杆菌phoA（碱性磷酸酶）启动子和信号肽序列。外源基因插入到信号肽序列后的酶切位点。 在磷酸盐饥饿时，外源蛋白表达。 由周质信号肽酶切下信号肽。 pINIII系统 D下游，编码信号肽， 可引导蛋白跨膜 2、优点：分泌表达，避免降解。 pINIII-A1：plas