通过大孔树脂柱层析和制备HPLC分离和纯化竹叶中具有抗氧化活性的4种C改稿.doc

通过大孔树脂柱层析和制备HPLC分离和纯化竹叶中具有抗氧化活性的4种C-糖苷黄酮 摘要：目前已研究了4种C-糖苷黄酮，即荭草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷的制备方法,而这些C-糖苷黄酮都是从乙醇提取物水溶液（即竹叶抗氧化物AOB）里通过AB-8大孔树脂和制备HPLC（流动相：10%和15%(V/V) 乙腈/1%醋酸）制得的。近而用甲醇和水分别作反溶剂和盐析剂，通过反溶剂结晶法来纯化得到这些C-糖苷黄酮。纯度是由分析HPLC谱图来估算的，而化学结构的确定是由IR，MS,NMR和UV谱图来确定的。由5LAOB浓缩液得到的6.5g粗品，柱层析后制得了荭草苷（49mg）、异荭草苷（142mg）、牡荆苷(15mg)、异牡荆苷(62mg)。这些方法比较适用于制备足量的纯C-糖苷黄酮，以确定竹叶中的荭草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷的量。 关键词：C-糖苷黄酮；大孔树脂；制备HPLC；反溶剂结晶；竹叶抗氧化物 简介 在生物学上，二级植物代谢物是活性物质，具有保护人体健康的非营养物。黄酮——植物多酚二级代谢物的一大类——广泛分布于药草、果实、茶叶等中。黄酮，存在于人类的食物中，对人体健康产生了特殊的作用，包括抗氧化活性，心脏血管疾病的防治，癌症的预防等。C-糖苷黄酮是黄酮家族的一个重要的一类，在一些植物中被发现，例如，紫檀树和葫芦科果实中。C-糖苷黄酮的多种生物活性已被报道过，包括异荭草苷（毛地黄黄酮-6-糖苷）和牡荆苷（芹菜素-8-糖苷）的抵抗金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，绿脓杆菌的抗菌活性，也包括毛地黄黄酮-7-糖苷对于抵抗由CCl4引起的肝伤。 竹叶抗氧化物（AOB）是一种从竹叶中提取出来的灰褐色粉末，能够阻碍脂肪的自动氧化的链反应，螯合过渡态的金属离子，清除亚硝酸化合物和阻碍亚硝胺的合成。另外，AOB是一种很强的抗氧化剂，能够抑制过渡金属离子和自由基诱导的体外高分子的恶变。在中国，AOB已被证明是一种新的食物抗氧化剂，它能够被加进疏松的食品，水产品，肉类，可食用油，谷类，面包，水果及蔬菜汁，茶饮料和油炸食品中，这些都已经过中国卫生部门认证。AOB的主要功能成分包括黄酮、内酯和酚酸，而C-糖苷黄酮是在AOB中的一种具有代表性的成分。AOB中的四种C-糖苷黄酮的化学结构，即荭草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷，如Fig.1所示。 先前我们研究组进行了代谢研究，报道了这四种C-糖苷黄酮在胃肠管道中很少被吸收，这种C-糖苷黄酮在体内很少吸收的特征表明它们可能在药理活性上有潜力。虽然黄酮的多种药理学效应已被报道在许多同行评审期刊中，但是很少有研究员把注意力集中在动物或人体中的C-糖苷黄酮的官能团特性上。这些方面研究状况部分归因于C-糖苷黄酮单体的获得。为了处理这个问题，研究员发现并使各种药草中的黄酮的制备技术更优化。高速逆流色谱（HSCCC）和制备型柱层析被广泛使用。制备HPLC和相关的技术是植物药草中活性成分的分离和纯化的一种有效的方法。然而，和HSCCC及柱层析相比，很少有研究员能用制备HPLC方法分离和纯化植物中C-糖苷黄酮，并使其优化。这个研究的目标是建立一种使用树脂柱层析和制备HPLC技术AOB中的四种C-糖苷黄酮（荭草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷）的分离和纯化的新方法。 2. 实验 化学药品 荭草苷（5，7，3′-4′-四羟基黄酮-8-糖苷）、异荭草苷（5，7，3′-4′-四羟基黄酮-6-糖苷）、牡荆苷（5，7，4′-三羟基黄酮-8-糖苷）、异牡荆苷5，7，4′-三羟基黄酮-6-糖苷）（HPLC级）从Extraynthese购买。乙腈和乙酸乙酯（都是HPLC级）从Tedia购买。甲醇（HPLC）级由Merck购买。研究中使用的其它所有溶剂和化学物质均为分析纯。蒸馏水在大孔树脂柱层析中使用，而通过Milli-Q系统净化的纯净水在HPLC中使用。将这4种C-糖苷黄酮溶解于50％（V/V）甲醇水溶液制得储存液和工作标准液。工作标准液能在4℃下稳定保存3个月 样品 AOB的浓缩液是由浙江大学Innoessen有限公司提供的。AOB由紫竹变种的竹叶制得的。简要的说，秋季在安吉采集新鲜的竹叶，然后干燥。在粉碎和过筛（20-40目）之后得到竹叶的粗粉，然后取10g粉末使用加热回流的方法用100ml30％(V/V)乙醇水溶液提取1小时，然后滤出液用滤膜分离，用来去除大分子和小分子物质（例如多糖和矿物质），最后真空浓缩之后得到AOB浓缩液，加到已处理好的大孔树脂柱层析中。 AB-8大孔树脂柱层析 用一个装满AB-8大孔吸附树脂（聚苯乙烯树脂、颗粒大小：0.3-1.25mm）的低压的玻璃层析柱（150cm×100mmLD）来作树脂柱层析。使用前树脂柱要经过预处理。详细的说，层析柱先用24L 5％（V/V）盐酸活化，然后平衡，即用蒸馏水以60