第二章遗传信息的表达.ppt

mRNA是遗传信息的携带者 3、真核基因在原核系统中表达的困难 (1)原核RNA pol 不能识别真核基因的启动子。（去除P） (2)从真核基因转录的mRNA缺乏S-D序列，不能结合到核糖体上，故不能直接翻译。（加S-D序列） (3)原核细胞缺乏真核细胞的转录后加工系统，不能切除真核基因中普遍存在的内含子，不能形成成熟的mRNA，因此，不能表达真核蛋白。（用cDNA） (4)表达的真核蛋白不稳定，易被细菌蛋白酶降解。（融合表达或分泌表达） 二、 外源基因在真核系统中的表达 （一）酵母表达系统 1.载体的特点（1）选择性标记（2）启动子（3）转录、翻译、终止信号（4）加尾信号（5）复制起始位点ori。 2.载体类型 1）质粒载体 可广泛用于表达外源蛋白，但在进行大于10L的大量培养时，质粒表达系统往往不够稳定。 分类:附加体型载体（yeast episomal plasmid, YEp）、复制型载体（ yeast replicating plasmid,YRp ）和酵母着丝粒质粒（ yeast centromere plasmid,YCp ） 3）酵母人工染色体 酵母人工染色体（ yeast artificial chromosome, YAC）是利用DNA重组技术组装的人工染色体，是目前容纳外源基因容量最大的载体（大于100kb），且高度稳定。它包括自主复制序列(ARS, autonomously replicating sequence)、着丝粒(CEN)、端粒(TEL)结构和选择标记等基本结构。现在又加上启动子和MCS,使YAC操作更加方便。 （二）杆状病毒（baculovirus）载体系统 1、常用的杆状病毒表达系统是AcMNPV，其基因组大约13kb，为环状dsDNA，通过构建一个转移载体可以将外源基因转移到病毒基因组中，实现外源基因在昆虫细胞中的表达。 2、转移载体是一个大肠杆菌质粒，含有一段AcMNPV 的DNA序列(包括多角体基因的启动子及其上游区、单克隆位点、多角体基因的终止子、加尾信号及下游DNA)。 （三）哺乳动物细胞的表达系统 人腺病毒载体 三、 外源基因表达的几种方式 （一）外源蛋白的非融合表达 1）非融合表达是指所表达的外源蛋白的N端不含任何其他的异源性氨基酸，因此要求起始位点(ATG)必须位于要表达的外源基因片段的5’端。将目的基因插入合适的启动子和S-D序列的下游，就可以在原核表达系统中表达出非融合蛋白。（S-D序列与ATG之间的距离只要改变2-3个碱基也会极大地影响表达效率。） 2） 常用的非融合表达措施是分泌表达，即在N段接一段信号肽序列（信号肽中含有许多疏水氨基酸和带正电荷的氨基酸，使整个信号肽的总电荷为正。），信号肽可以帮助蛋白质穿过质膜，促进分泌。蛋白质穿过质膜后信号肽被信号肽酶切除。 一、外源基因在原核系统中的表达（翻译） 在紧靠起始密码子（AUG）的上游有一段约6-8个核苷酸的序列5′-AGGAGGU-3′，是核糖体与mRNA 的结合部位，叫Shine-Dalgarno序列，简称S-D序列。 1、S-D序列 2、常用的原核表达载体 （1）含lac启动子的表达载体 特点：A.含有编码lacZ的序列，外源基因正确插入后可与? -半乳糖苷酶形成融合蛋白。B.含lac启动子的表达载体可被IPTG（硫代半乳糖苷）诱导。 特点：A.其外源蛋白表达量比含Lac启动子的载体系统高。B.该载体可被IAA（3- ? -吲哚丙烯酸）诱导表达。 (2)含有trp启动子的表达载体 (3)含有tac启动子的表达载体 特点：A. tac启动子是lac和trp启动子构建的杂合启动子，比lacUV5启动子强10倍，是非常强的启动子。B.有来自?噬菌体的转录终止子T1和T2，以防过度转录。C.可以被ITPG诱导。 (4)含有PL启动子的表达载体 特点：A.是一个温度调节启动子，在29-310C时PL启动子处于阻遏状态，当温度升高到420C时PL启动子的阻遏被解出，基因开始大量表达。B.当该载体转染受体菌N99 cI+时，由于受体菌能合成cI蛋白，使载体在370C时能大量复制。 4000bp o p t1 Hpa I 2）整合型载体 这类载体不含酵母自主复制序列，故不能独自在细胞中复制，必须整合到酵母染色体中后才能使外源基因得以表达。 leu2+ MCS ARS CEN TEL TEL YAC 图示 3’DNA 终止子 单克隆位点 P 5’DNA 载体DNA 载体DNA 转移载体 3′ 5′ AcMNPV DNA 重组杆状病毒表达系统图示 外源基因 多角体 蛋白基因 转移载体 DNA复制大致分为三个阶段，即复制的起始、DNA链的延长和复制的