细胞生物学研究方法及其在中医研究中的应用.pptVIP

方法：细胞分离、固定、染色、通过、检测、分析。可以分析单细胞和群体细胞。速度：5000个细胞/秒！FCM可用于测量细胞的多种参数，其中有些细胞参数不经染色处理就能直接测量，如细胞大小、形状、胞浆颗粒、色素含量、蛋白荧光及氧化还原状态等；一些参数必须经染色（荧光标记）后才能测量，如DNA 含量与碱基比、染色质结构、 RNA含量、总蛋白、碱性蛋白、巯基、表面抗原、细胞骨架组成、膜完整性与通透性、酶活性、内吞作用、表面电荷、细胞内受体、DNA合成、凋亡、膜流动性与微粘度、表面受体、胞浆与线粒体膜电位、膜结合Ca++、胞浆Ca++、细胞内pH等。 流式免疫荧光技术进行免疫细胞标记：以明确淋巴瘤的起源细胞类型。 Thy1（CD3抗体）： T细胞特异性抗体 B220（ CD45R ）：B细胞特异性抗体 J： wild-tpye淋巴结 K： Mus81+/-T系淋巴瘤 L：Mus81+/-B系淋巴瘤 流式细胞计数 （二）显微分光光度计（MSP） MSP（microspectrophotometer，细胞光度计），光学显微镜+荧光显微镜+分光光度计。对细胞内的某些重要的生物分子（如DNA 、RNA、蛋白质等）的含量进行定量测试。 （三）图像分析系统（IAS） IAS是分析细胞学中的主要测量手段之一，常用于细胞形态分析、白细胞和红细胞分类、肿瘤细胞分析、染色体核型分类、微血管系统分析等方面。 （四）激光共聚焦仪（interactive laser cytometer） 建立于显微分光光度计与流式细胞计基础之上，研究单细胞水平的结构、功能、应答反应。 第二节 细胞生物学在中医药研究中的现状 细胞培养技术在中医药研究中的应用，现有文献主要涉及药用植物组织（细胞）培养，有效中药的筛选，中药药理及毒理研究等方面。 一、药用植物与动物细胞培养 二、细胞生物学在中药药理研究中的应用 中药及复方的细胞药理学给药方式主要有两种。 其一，将中药及复方的粗制剂直接加入细胞培养体系中。由于粗制剂存在不少杂质成分，它们未经过肠道选择性吸收及体内的代谢过程，从而影响到实验结果。 其二，血清药理学给药。1984年日本学者提出了给动物灌服中药一定时间后采血，分离血清，用此含药物成分的血清进行体外实验，1988年命名此新的药理学实验方法为中药“血清药理学”。近年来国内外应用血清药理学方法研究中药及复方积累了一定的经验。从目前已有的工作来看，中药血清药理学方法可能具有以下优点： 1）中药粗制剂经口服吸收后，用含药血清进行体外实验，可排除中药粗制剂中杂质成分、各种电解质或鞣质成分、不同酸碱度等各种干扰因素的影响，比较接近药物体内环境中产生药理效应的真实过程。 2）对体外实验有效的中药复方，如果其有效成分不能从胃肠道吸收或经体内吸收代谢后失活，则血清药理学方法可避免体外实验得出的错误结论。 3）对某些本身无直接作用，但经体内代谢后产生作用的药物，血清药理学可分辨出来。 如何应用？ 以二仙汤研究为例。 ——引自董冰峰硕士论文 背景介绍： 1．二仙汤的由来和构成。 2．治疗更年期综合征的国内外现状。 3．动物实验的验证和机理研究。 问题： 1．作用部位，直接的还是间接的？ 2．有效组分，拆方、单味中药、有效成分？ 3．血清药理学与直接给药的异同？ 1．二仙汤及其拆方对大鼠垂体细胞LH表达的作用 （1）二仙汤及拆中，滋阴（ZY）组含药血清有显著的促进作用。 （2）二仙汤全方及滋阴、当归直接给药，均能明显促进垂体前叶细胞LH水平的提高。温肾组有一定升高的趋势。 二仙汤及拆方血清对垂体LH表达的作用 二仙汤及拆方直接给药对垂体LH表达的作用 NS-正常大鼠血清对照，Control-空白对照；QF-全方，WS-温肾，ZY-滋阴，DG-当归 以上的差别说明什么问题？ 1）给药方式差异及可能的机理。 2）实验要求重复。 3）筛选成分及成分组合的增加。 （3）淫羊藿苷和仙茅苷两种有效成分与DMSO溶剂组比较，均有提高培养液中LH水平的趋势。 中药有效成分对垂体前叶细胞分泌LH的作用 Control对照；DMSO对照；YYH-DMSO+淫羊藿苷；XM- DMSO+仙茅苷 2．二仙汤及其拆方对大鼠垂体FSH表达的作用 （1）二仙汤及拆方药物血清对垂体细胞FSH表达均有一定的降低趋势。 二仙汤全方及拆方血清对垂体前叶细胞FSH的作用 NS-正常大鼠血清对照组，QF-全方，WS-温肾，ZY-滋阴，DG-当归 （2）二仙汤及拆方直接给药可以明显增强垂体前叶细胞FSH的水平（P0.01）。温肾组浓度低作用反而增强；全方浓度低，作用弱（P0.01）；而滋阴方浓度变化区别不明显