牛支原体的环介导等温扩增快速检测技术研究.pdfVIP

Online system: http://www.j 业 生 物 技 术 学 报 Journal of Agricultural Biotechnology 2012, 20(2): 218~224 DOI: 10.3969/j .issn.1674-7968.2012.02.015 技术改进 Updated Technology 牛支原体的环介导等温扩增快速检测技术研究 侯轩 付萍 张海燕 张跃伟 吴文学* 中国农业大学动物医学院，北京 100193 * 通讯作者，wuwenxue@ .cn 要 牛支原体 (Mycop lasma bov is) 是感染牛的一种重要的致病性病原体。本研究利用环介导等温扩增 (loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术建立了牛支原体的快速检测方法。该方法以牛支原体 守性 因uv rC 为靶序列设计了5 条特异引物，在58 等温条件下，60 min 即可完成反应。LAMP 方法能检 测出20 pg 牛支原体DNA ，较PCR 方法高100 倍，用牛鼻支原体(M. bov irhinis) 、无乳支原体(M. agalactiae)、 精氨酸支原体(M. ariginini) 、牛副流感病毒(BPIV) 、牛腺病毒(BADV) 、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)作特异 性检测，两种方法均有很高的特异性。本研究还将荧光显色剂钙黄绿素(calcein)和Mn2+ 用于LAMP 反应结 果的可视化检测。临床鼻拭子样品煮沸后，可直接进行等温扩增，省去了DNA 提取步骤。在对167 个临床鼻 ， 拭子样本的检测中 LAMP 方法检测结果阳性率(26.95%)高于PCR 方法检测出阳性率(19.16%)，这证明本研 究所建立的方法，与PCR 法比较更适于临床样品的检测。研究结果表明，LAMP 方法具有操作简便、快速、高 效、 感、特异、经济等特点，适于 层实验室监测的广泛使用。 关键词 牛支原体(Mycop lasma bov is) ，环介导等温扩增(LAMP) ，PCR Development of Loop-mediated Isothermal Amplification for Rapid Detection of Mycop lasma bov is HOU Xuan FU Ping ZHANG Hai-Yan ZHANG Yue-Wei WU Wen-Xue* College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, Beijing 100193, China * Corresponding author, wuwenxue@ Ab stract Mycop lasma bov is is an important pathogen in cattle. In this research we developed a new and rapid test method for Mycop lasma bov is with loop-mediated isothermal amplification(LAMP). With the 5 specific primers targeting to a total of six distinct sequences on the conservative gene uv rC, the new method could be completed in 60 min under the isothermal condition of 58 . With the LAMP method, we could detect 20 pg DNA of M. bov is, which was 100 times lower than using the method of PCR. In