大苞鞘石斛原球茎玻璃化超低温保存技术的研究[J].pdfVIP

中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2011, 33(3): 279−287 大苞鞘石斛原球茎玻璃化超低温保存技术的研究 吴元玲　申晓辉* (上海交通大学农业与生物学院, 农业部都市农业(南方)重点开放实验室, 上海200240) 摘要　　本文研究建立了大苞鞘石斛(Dendrobium wardianum Warner)原球茎玻璃化法超低温 保存的技术体系。结果发现, 预处理和玻璃化溶液(plant vitrification solution 2, PVS2)装载脱水是影 响大苞鞘石斛原球茎相对存活率的两个关键步骤, 高渗与低温- 高渗两种预处理方法测定的相对存 活率具有显著性差异; 玻璃化溶液的种类以及脱水时间对冻后存活率具有重要的影响。基于此, 建 立了大苞鞘石斛原球茎的超低温保存体系, 即: 以继代培养60 d 的大苞鞘石斛原球茎为材料, 1/2 MS+0.8 mol/L 蔗糖的培养基上4 ℃低温预处理6 d 后, 转至1/2 MS+2 mol/L甘油+0.4 mol/L 蔗糖的 装载液中室温下装载40 min, 在0 ℃下装载PVS2 脱水40 min, 然后转入装有新鲜PVS2 冷冻管中并 迅速投入液氮。在液氮保存1 h 后放在40 ℃水浴中快速解冻1 min, 利用含1.2 mol/L 蔗糖的1/2 MS 培养液洗涤3 次, 每次间隔10 min; 待恢复培养30 d后统计存活率, 可使大苞鞘石斛原球茎超低 温保存后存活率达到20.0% 。 关键词　　大苞鞘石斛; 原球茎; 玻璃化; 超低温保存 大苞鞘石斛, 又名腾冲石斛, 为兰科(Orchidaceae) 有简便、成本低、保存材料遗传性稳定等优点[8], 现已 石斛属(Dendrobium) 多年生附生兰, 花大、色艳, 花 应用于兰科植物鹤顶兰(Phaius tankervilleae)种子[9] 、 期长, 是石斛属中观赏价值很高的种类[1]; 另外, 新鲜 大花蕙兰 “ 幻影”(Cymbidium hybridum Walu “Idol”) 或干燥茎可入药, 有益胃生津、滋阴清热的功效[2] 茎尖、原球茎[10] [11] 。 , 白芨(Bletilla striata)合子胚 , 香荚 作为我国兰科第二大属的野生种类, 大苞鞘石斛对生 兰( Vanilla planifolia “Andrews”)茎尖[12], 血红石斛 态环境要求严格, 现仅分布于我国云南东南部至西部 (Dendrobium cruentum Rchb.f.) 原球茎[13], 以及铁皮 海拔1 350~1 900 米热带雨林中, 缅甸、泰国和印 [14] [15,16] 石斛(Dendrobium candidum)种子 、原球茎 和原 度东北部也有分布。由于石斛属植物生长缓慢, 种 生质体[17], 但大苞鞘石斛超低温保存技术尚未见报道。 子极其微小, 且胚具有生理后熟现象, 自然条件下繁 本文以大苞鞘石斛原球茎为试验材料, 研究探讨 殖率极低(种子萌发率低于5%)[3]; 加之长期非法采挖, 了玻璃化法超低温保存技术体系中预处理和脱水2 致使多种石斛原生种已濒临灭绝。自1987 年开始, 个关键步骤细胞相对成活率变化规律, 以期为实现长 石斛先后被列为《中华人民共和国珍稀濒危植物名 期稳定保存石斛属珍贵野生植物种质资源提供科学 录》、《濒危野生动植物种国际贸易公约CITES 》 依据。 中II 级保护植物, 2001 年石斛属全部被列入《国家 [4] 重点保护野生植物名录(第2 批) 》。但到目前为止