第六章 重组克隆载体引入受体细胞.pptVIP

第六章 重组克隆载体引入受体细胞 6.1 基因工程受体细胞 6.1.1 受体细胞的特性 作为基因工程的宿主细胞必须具备以下特性： 便于重组DNA分子的导入； 能使重组DNA分子稳定存在于细胞中； 便于重组体的筛选； 遗传性稳定高，易于扩大培养或发酵生长； 安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染； 有利于外源基因蛋白表达产物在细胞内的积累，或促进外源基因的高效分泌表达。 在遗传密码的应用上无明显偏倚性； 具有较好的翻译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达； 在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。 受体细胞的类型 原核生物细胞 优点 缺点 真核生物细胞 真菌细胞（如酵母） 植物细胞 动物细胞 6.1.2 重组体分子导入受体细胞的途径 概念 转化 转染 转导 6.2 重组体DNA分子的转化或转染 感受态 就是受体菌接受外源DNA能力的一种生理状态，一般是在生长对数期的后期，时间很短暂。 转化机理* 1 用氯化钙制备新鲜的感受态细胞转化法 2 用复合剂制备感受态细胞转化法 3 高压电穿孔转化法（电转化法） 6.4 重组克隆载体导入哺乳动物细胞的转染 1 磷酸钙和DNA共沉淀物转染法 2 DEAE-葡聚糖介导转染法 3 利用Polybrene（聚季铵盐）的DNA转染法 4 利用原生质体融合的DNA转染法 5 电穿孔法DNA转染 名词解释 受体细胞 是指在转化和转导中接受外源基因的宿主细胞。 转化（transformation） 把带有目的基因的重组质粒DNA引入受体细胞的过程称为转化。 转染（transfection） 将重组噬菌体DNA直接引入受体细胞的过程称为转染。 转导（transduction） 若重组噬菌体DNA被包装到噬菌体头部成为有感染力的噬菌体颗粒，再以此噬菌体为运载体，将头部的重组DNA导入受体细胞中，这一过程称为转导。 原核生物细胞 优点： 大部分原核生物细胞无纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源DNA的进入。 没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，为外源DNA与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦。 原核生物多为单细胞生物，容易获得一致性的实验材料，并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。 基因组小，遗传背景简单，并且不含线粒体和叶绿体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析。 缺点： 原核生物细胞不具备真核生物的蛋白质折叠复性系统，即使真核生物基因能得到表达，得到的多是无特异性空间结构的多肽链。 原核生物细胞缺乏真核生物的蛋白质加工系统，而许多真核生物蛋白质的生物活性正是依赖于其侧链的糖基化或磷酸化等修饰作用。 原核细胞内源性蛋白酶易降解异源蛋白，造成表达产物不稳定。 至今被用作受体菌的原核生物有大肠杆菌、枯草杆菌、蓝细菌等。 大肠杆菌受体细胞 大肠杆菌属革兰氏阴性菌，它是目前为止研究得最为详尽、应用最为广泛的原核生物种类之一，也是基因工程研究和应用中发展最为完善和成熟的载体受体系统。 优点：繁殖迅速、培养简便，代谢易于控制。 缺点：大肠杆菌细胞间隙中含有大量的内毒素，可导致人体热原反应。 枯草杆菌受体细胞 枯草杆菌又称枯草芽孢杆菌，是一类革兰氏阳性菌。 优点： 枯草杆菌具有胞外酶分泌－调节基因，能将具有表达的产物高效分泌到培养基中，大大简化了蛋白表达产物的提取和加工处理等，而且在大多数情况下，真核生物的异源重组蛋白经枯草杆菌分泌后便具有天然的构相和生物活性。 枯草杆菌不产生内毒素，无致病性，是一种安全的基因工程菌。 枯草杆菌具有芽孢形成的能力，易于保存和培养。 枯草杆菌也具有大肠杆菌生长迅速、代谢易于调控、分子遗传学背景清楚等优点。 应用：已成功的用于表达人的β干扰素、白细胞介素、乙型肝炎病毒核心抗原和动物口蹄疫病毒VPI抗原等。 蓝细菌（蓝藻） 蓝藻——又称蓝绿藻或蓝细菌，它含有叶绿素a(缺乏叶绿素b)和藻胆素，具有光合系统Ⅰ (PS Ⅰ) 和光合系统Ⅱ (PS Ⅱ)、能进行光合作用，但它又具有细菌的特征，无细胞核及双层膜结构的细胞器，染色体裸露，是一种典型的原核生物。 蓝藻作为表达外源基因的受体菌兼具微生物和植物的优点，具体表现在： 基因组为原核型，除了裸露的染色体DNA外，不含叶绿体DNA和线粒体DNA，遗传背景简单，便于基因操作和外源DNA的检测。 细胞壁属G－，主要由肽聚糖组成，便于外源DNA的转化。 营光合自养生长，培养条件简单，只需光、CO2、无机盐、水和适宜的温度就能满足生长需要。 多种蓝藻含内源质粒，为构建蓝藻质粒载体提供了极好的条件。 蓝藻富含蛋白质，并且多数蓝藻无毒，早已用作食物或保健品，在此基础上采用转基因技术，把一些重要药物的基因转入无毒蓝藻，就可达到锦上添花的效果。 真核生物细胞 真菌受体细胞 真菌是低等的真核生物，