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第 12 卷第 2 期 2012 年 4 月  过 程 工 程 学 报 The Chinese Journal of Process Engineering 亲和层析介质上蛋白质偶联位点的控制方法  Vol.12 No.2 Apr. 2012  冯静  1,2  ，黄孟军  1,2  2222  2  (1. 北京中医药大学中药学院，北京 100102；2. 中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京 100190)  摘  要：以溶菌酶为模型蛋白，将其偶联在环氧活化的琼脂糖介质上，采用液质联用技术结合蛋白质酶切技术对琼脂 糖介质表面配基蛋白的偶联位点进行了识别，考察了活化时间、偶联时间和溶液 pH 值对偶联位点的影响. 结果表明， 环氧基密度为 11.34??mol/g、反应 pH 9.5 条件下，溶菌酶偶联位点发生在 K96，延长偶联反应时间蛋白配基偶联量增 加，对偶联位点种类无显著影响；增加环氧基密度或提高偶联反应 pH 值使溶菌酶通过多种位点偶联，在 pH≥10.5 条 件下偶联位点主要发生在 K33, K96 和 K97. 关键词：亲和层析介质；蛋白质配基；偶联位点；质谱分析；蛋白质酶解 中图分类号：Q503 文献标识码：A 文章编号：1009?606X(2012)02?0277?06  1  前言  究仍大多以经验性探索为主，优化反应条件以提高间隔 亲和层析技术具有分离效率高、特异性强、活性损 失率低和操作简便等优点，在分离纯化蛋白质药物、抗 [1] 和配基之间的相互作用是亲和层析的基础，对于以蛋白 质为配基的亲和层析介质，蛋白配基在介质表面上的偶 联位点影响其空间取向，进而影响配基与目标蛋白质之 间的相互作用. 因此，研究蛋白质配基在亲和介质表面 的偶联位点控制方法对提高分离效率和亲和层析介质 研制具有重要意义. 亲和介质的制备过程涉及空白介质活化、配基偶 联、封闭未偶联位点、清洗保存等步骤[2]，其中介质活 化及配基偶联过程是影响介质性能的关键. 常用的介质 [2] [3] [4] 等. 偶联过程主要受活化基团密度、偶联反应 pH 值、 偶联温度、偶联时间等影响. 目前与亲和介质相关的研 臂密度及偶联的亲和配基密度和活性等[5?7]. 探索亲和 配基在介质表面上的空间取向和偶联位点存在一定难 度. Keigo 等 [8,9]曾尝试利用飞行时间二级离子质谱 (TOF-SIMS-MS)研究以化学交联法和生物固定法将溶 菌酶蛋白偶联于修饰后的载玻片上的蛋白连接取向，该 方法仅能获得在界面暴露的蛋白信息，并推断其发生偶 联反应的蛋白侧面，不能明确给出蛋白发生偶联的具体 氨基酸位点. 受仪器采样深度影响，该方法的样品采集 深度仅为 2 nm，不适合研究所有界面偶联蛋白的构象及 连接位点. Luigi 等[10]、Helén 等[11]分别尝试采用核磁共 振技术(NMR)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALDI-TOF MS)研究蛋白在材料表面吸附的位点，但 在定量分析方面存在局限性. . 高效液相?质谱技术(HPLC?MS)及蛋白质酶解技  图 1 蛋白酶解结合 HPLC?MS 识别介质表面蛋白偶联位点流程图 Fig.1 Schematic diagram of identification of the coupling site of protein on chromatographic media using enzymatic digestion and HPLC?MS 收稿日期：2012?02?13，修回日期：2012?03?20 基金项目：国家自然科学基金资助项目(编号20906094；20820102036) 作者简介：冯静(1986?)，女，河北省石家庄市人，硕士研究生，微生物与生化药学专业，张贵锋，通讯联系人，Tel.: 010 E-mail: gfzhang@home.ipe.ac.cn. 278  过 程 工 程 学 报  第 12 卷 术在研究生物大分子间相互作用、蛋白质结构和修饰位 点等方面日趋成熟，但未见用其分析蛋白配基在介质表 面偶联位点的报道. 本研究以溶菌酶为模型蛋白，将其 偶联在琼脂糖介质表面，将 HPLC?MS 技术和蛋白质限 制性酶切技术结合，在识别介质表面配基偶联位点的基 础上，系统考察了活化时间、偶联时间和溶液 pH 值对 琼脂糖介质表面上配基偶联位点的影响，并成功探索出 一种控制蛋白质在固相支持物表面偶联位点的方法，不 仅为以蛋白为配基的亲和层析介质的制备工艺优化提 供技术支持，同时还可将该方法拓展应用于酶的固定 化