全自动（定量PCR）基因扩增诊断仪配套定量试剂的研制.docVIP

全自动（定量PCR）基因扩增诊断仪配套定量试剂的研制 作者：郭晏海　阎小君　孟宪润　崔大祥　侯瑜　韩锋产　冯永强　张菊　赵锦荣 【关键词】 定量PCR 　　关键词: 定量PCR;探针杂交;定量试剂 　　摘 要:目的 研制一种能用于仪器操作的灵敏、快速、特异的定量试剂. 方法 使用一个生物素标记的上游引物，对HBV DNA及其竞争模板DNA进行不对称PCR扩增，使扩增出的单链带有生物素，并可结合在固定有链亲合素的微孔板的表面.用标有辣根过氧化物酶的待测模板探针和竞争模板探针分别与两个微孔中固定的相应单链PCR产物杂交，而后加底物显色，测定吸光度进行分级定量分析. 结果 该定量方法可以检测10拷贝数的模板，而且对简便处理的标本适应性强;以分级定量的形式定量时，具有良好的重复性. 结论 该试剂适用于仪器操作，可对临床血清中HBV DNA进行分级定量分析. 　　Keywords:quantitative PCR;probe hybridization;quantita-tive kit 　　Abstract:AIM A sensitive，rapid and specific quantitative reagent used in quantitative PCR instrument was researched and the content of HBV DNA in serum was quantified. 　　METHODS The HBV DNA and the competitive DNA tem-plate were asymmetrically amplified by a bio-labeled up-stream primer，the single string PCR products with Biotin were combined to the surface of the streptavidin fixed wells.Then the HRP-labeled sample probe and the competitive probe were hybridized with the single-string PCR products fixed in two wells respectively，and then the substrate was added to and Ab values were examined.The result of quanti-tative assay was given by computer.RESULTS 10copy template can be quantified by this kit.The simple preparation of samples DNA is also adapted to this kit and the results can be repeated.CONCLUSION This kit can be used in instru-ment and quantify the content of HBV DNA in serum. 　　0 引言 　　用PCR技术进行核酸定量分析，有较大的难度.首先，PCR在扩增过程中，初期扩增产物量与循环数呈指数关系，在扩增后期进入平台期，定量分析应在指数关系区进行.但由于PCR扩增效率受多种因素的影响，使得这种定量条件很难控制.二是临床样品中待测核酸含量值跨度很大（可能在1～106 拷贝/μL），对于跨度如此之大的检测对象，要进行准确定量本身就很困难.竞争PCR定量方法虽不受扩增平台期现象的影响，但该方法定量的量程窄，要测定临床标本的核酸含量，就需用多个不同浓度的竞争模板分别对同一样品进行多次检测.为了克服竞争PCR定量方法的缺点，便于仪器自动检测，我们采用竞争PCR产物杂交―酶标显色法进行分级定量.这种定量方法克服了以往竞争PCR定量的不足，初步实现了半定量核酸分析. 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 主要仪器与试剂:全自动（定量PCR）基因扩增仪（本所）;pUC19HBV DNA质粒为本所克隆.引物与探针:PCR引物源于HBV DNA X基因区［1］ ，引物:B1（1402～1421）5’-Bio ATCCT-GCGCGGGACGTCCTT3’;B2（1626～1607）5’-CGTTCACGGTGGTCTCCATG3’，探针位置与序列为（1600～1580）5’HRP-TGCACTTCGCA