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光谱法研究茜素黄GG与牛血清蛋白的相互作用 王 欢* 杨小玲 （咸阳师范学院化学与化工学院，陕西咸阳，712000） 摘要：通过荧光光谱法、紫外吸收光谱法，研究了BSA与茜素黄GG的相互作用。在pH=6.26的Tris-HCl缓冲溶液中，牛血清蛋白与茜素黄GG相互作用，荧光光谱发生猝灭，其猝灭程度与茜素黄GG用量含量成正比。运用摩尔比法、双倒数法计算了相互作用的结合常数，基于Forster非辐射能量转移理论估算了牛血清蛋白与茜素黄GG之间的结合距离r= 3. 57。同步荧光法研究了茜素黄GG加入对BSA构象的影响。 关键词：牛血清蛋白；茜素黄GG；荧光光谱法；紫外吸收光谱法 蛋白质是细胞内的功能分子，在所有的生命过程中起着关键的作用，具有运载和储存功能，其特定结构与其生物功能密切相关[1]。血清蛋白是血浆中最丰富的蛋白质，具有许多重要的生理功能，可与许多化学物质结合，通过血液在体内进行。茜素黄间硝基苯偶氮水杨酸钠偏铬黄媒染黄茜素黄GCl3H8N3NaO5，属单偶氮染料用于棉、毛、丝和锦纶织物的染色，是酸性媒介染料。通过研究与血清白蛋白相互作用，可获取化学物质在体内被转运、分配和代谢过程的重要信息。[10]。BSA储备溶液：1.0×10-5 mol/L，茜素黄GG的储备液：1.0×10-2 mol/L，两种标准溶液都在0—4℃的冰箱中保存，实验所需溶液由此稀释而得。pH分别为6.26和7.40的Tris-HCl缓冲液，浓度为0.1 mol/LNaCl溶液。 1.2 实验仪器 RF-5301PC荧光光谱仪，日本岛津；ZF-7A型紫外照射仪，上海嘉鹏科技有限公司；KQ5200DE型超声波仪，昆山市超声仪器有限公司；BS 224S型精密电子天平，蒙多利斯科学仪器(北京)有限公司；SPECORD 50型紫外可见分光光度计 1.3 实验方法 在一组10 mL比色管中，依次加入0.1 mol/L NaCl溶液1.00 mL、1.0×10-5 mol/L BSA溶液1.00 mL，最后加入系列量1.0×10-4 mol/L茜素黄GG溶液，用pH为6.26的Tris-HCl缓冲溶液定容至刻度线，混匀，在室温下放置30min。固定荧光激发波长为285 nm，狭缝宽度均为3 nm，绘制300~450 nm的发射光谱图，并测定240~500 nm的紫外—可见吸收光谱。将缓冲溶液pH改为7.42，其余同上，再次测定，绘图。固定荧光发射与激发的波长差分别为△λ=15 nm和△λ=60 nm，进行同步荧光光谱扫描并绘制室温下的同步荧光光谱图。 将溶液在253.7 nm紫外灯下照射不同的时间，然后静置一段时间，测定荧光发射光谱。 2 结果与讨论 2.1 紫外可见吸收光谱 由图1茜素黄GG与BSA反应前后的紫外可见光谱也可看出，BSA在280nm附近有最大吸收，而茜素黄GG的最大吸收波长分别在260nm和360nm左右，向BSA中加入一定量的茜素黄GG后，BSA在280nm的吸收峰显著降低并且发生蓝移，说明茜素黄GG与BSA发生了相互作用。 2.2 荧光猝灭光谱 BSA由于其自身的色氨酸残基和酪氨酸残基产生λex/λem=285nm/340nm的内源荧光，而茜素黄GG在λex=285nm时并无荧光产生。当以285 nm激发时其特征荧光峰在340 nm左右。固定BSA浓度，在激发波长285 nm条件下，测得含不同浓度的茜素黄GG时体系的荧光光谱如由图2所示。固定BSA的量，随着茜素黄GG浓度的逐渐增大，BSA的荧光强度有规律的降低，这说明茜素黄GG对BSA的荧光有猝灭作用，这种作用可能引起BSA中 荧光发色团的微环境及蛋白质分子构象行为的变化。 2.3 茜素黄GG对BSA的荧光猝灭作用 荧光猝灭的原因有3种，动态猝灭，静态猝灭以及非辐射能量转移[11]。 以茜素黄GG滴定BSA时在341 nm处相对荧光强度F0/F(F0为BSA溶液341 nm处荧光峰的强度，F为加入茜素黄GG后341 nm处的荧光峰强度)为纵坐标，以CQ(茜素黄GG的浓度)为横坐标作图[12]。 由图3可以看到，当pH为6.26时，直线线性较好，当pH为7.42时，随着CQ的增大，直线有上弯趋势，在物质的量之比小于10时直线线性较好。这是因为随着茜素黄GG的加入，对BSA发生了荧光猝灭现象，为证实其猝灭方式，先将此过程按动态猝灭处理，根据Stern-Volmer[13]方程 F0／F=1＋Kq·τ0[Q]=1＋K·[Q] (1) (1)式中F和F0分别为有无茜素黄GG时的荧光强度，Kq为双分子猝灭常数，τ0为荧光发射体在无猝灭剂茜素黄GG存在时荧光寿命，[Q]为其浓度，Ksv为Stern-Volmer猝灭常数。当pH为7.