氯通道在过氧化氢预处理PC12细胞适应性神经保护中的作用.pdfVIP

摘 要 目的：1）研究氯通道在H O 诱导 PC 12 细胞凋亡中的作用；2）探讨氯通道在H O 预处 2 2 2 2 理适应性神经保护中作用及可能的作用机制。 方法：1）流式细胞术检测凋亡；2）Hoechst 核染色法观察细胞膜通透性；3）膜片钳技 术记录全细胞电流；4）Scion Image 图像分析软件测量并计算细胞体积；5）激光共聚焦免 疫荧光技术、WesternBlot 测定 ClC-3 氯通道蛋白含量。 结果: 1. H O (300 mol/L, 24h)致(70.2±3.2)%细胞凋亡。低浓度 H O (100 mol/L)预处 2 2 2 2 理或加入氯通道阻断剂 NPPB ( 100 mol/L)可抑制凋亡。 2. H2O2 可诱导凋亡性细胞容积减小(Apototic Volume Decrease, AVD)，呈时间和剂量 依赖性。NPPB 可抑制 H2O2 诱导的 AVD 。 3. Hoechst33258 染色示300 mol/L H2O2 诱导凋亡 1h 后，大部分细胞出现细胞膜通 透性增高(膜透化)，NPPB 可阻断膜透化作用。 4. 给与 H O (300 mol/L)后激活一逐渐增大的氯电流，NPPB 能有效阻断该电流。 2 2 5. 预处理浓度的 H O (100 mol/L)能激活 55%细胞产生氯电流，其特性与 300 mol/L 2 2 H2O2 所激活的有差异。 6. 47%低渗刺激预处理细胞诱发产生容积激活性氯电流，与对照组相比，其电流增大， 对 NPPB 的敏感性增加。细胞肿胀程度降低，调节性容积回缩(RVD)增强，NPPB 完全阻 抑 RVD 。 7. 与对照组比较，预处理后的细胞 ClC-3 氯通道蛋白表达增加。 结论：1）氯通道可能通过 AVD 和膜透化而参与 H2O2 诱导 PC12 细胞凋亡；2 ）ClC-3 氯 通道的表达和功能增强可能是 H O 预处理所诱导的神经保护的机制之一；3 ）氯通道在预 2 2 处理过程中可能通过增强细胞容积调节能力而起到神经保护作用。 关键词：氯通道；细胞凋亡；预处理；神经保护；膜片钳技术 I Abstract Objective: 1) To assess the roles of chloride channels in apoptosis induced by hydrogen peroxide in pheochromocytoma cells (PC12). 2) To investigate the roles and mechanism of volume-activated chloride channels in neuroprotection induced by H O preconditioning. 2 2 Methods: 1) Apoptosis was monitored by flow cytometery. 2) Nuclear staining was evaluated by Hoechst 33258. 3) The whole-cell patch clamp technique was used to record volume-activated chloride currents. 4) The Scion Image