NDPK-A及突变体与AMPK体外磷酸化及相互作用蛋白研究.pdfVIP

暨南大学硕士论文 摘 要 目的：构建pMO-NDPKA WT 及其一系列突变体pMO-NDPKAs(C4S、C109S、C145S、 C4/109/145S)真核表达载体，为NDPKA 蛋白质相互作用研究提供基本的工具；研究持续 活化和kinase dead 的AMPK 对野生型NDPKA 及S120 和H118 突变体的体外磷酸化作用， 探究NDPKA 蛋白磷酸化的关键位点和活化机制。探索NDPK-A/AMPK 与CFTR 之间的 可能相互作用，为NDPK-A 的新生物功能（调节上皮细胞氯离子通道和离子转运）研究 提供新的思路。 V5 pMO-NDPKA 方法：通过质粒重组基因克隆技术，构建带 标签的 野生型及其突变体真核 表达载体。通过瞬时转染方法，使各种质粒能够在HEK293细胞中获得表达，免疫共沉淀 技术结合同位素标记建立体外磷酸化分析实验，研究AMPK、NDPKA体外磷酸化作用。优 化NDPK/AMPK/CFTR相互作用研究的实验条件，免疫共沉淀、免疫沉淀、GST-pulldown 等方法探讨CFTR NDPK AMPK三者之间潜在的相互作用关系。 结果：成功构建 pMO-NDPKA WT 及其突变体 pMO-NDPKs(C4S 、C109S 、C145S 、 C4/109/145S)真核表达载体，瞬时转染HEK293 细胞之后均获得蛋白表达；野生型NDPK-A 能够自身磷酸化，且在持续活化型AMPK（AMPK-CA）存在下，自身磷酸化增强，但 kinase dead AMPK WT NDPK-A S120 3 的 并不能显著增强 的自身磷酸化； 的 个突变体中， S120A 磷酸化活性比WT 略有增强，但无显著性差异，S120D/S120E 的自身磷酸化活性 H118F AMPKalpha CFTR NDPKA 下降， 突变体无自磷酸化活性； 能够与 结合，也能够与 结合，但是CFTR 与NDPK 没有直接的结合或相互作用关系。 1 NDPK-A H118 NDPK-A 结论：（ ） 自身磷酸化发生在 位，意味着， 的自身磷酸化依赖于 NDPK-A AMPK NDPK-A 该蛋白的组氨酸激酶活性； 可接受来自 的活化磷酸基，从而增强 的自身磷酸化，但这种增强作用依赖于AMPK 的活化，仅仅与AMPK 结合并不能增强 NDPK-A 2 AMPKalpha CFTR NDPK-A 的自身磷酸化。（ ）免疫沉淀结果表明， 可分别与 和 作用，NDPK-A 可能通过AMPK 间接调控CFTR 活性，从而调节上皮细胞的离子转运。 关键词：NDPK-A,AMPK ,体外磷酸化,CFTR,免疫共沉淀 I 暨南大学硕士论文 ABSTRACT ABSTRACT AABBSSTTRRAACCTT Objective: Objective: OObbjjeeccttiivve