高效液相色谱分析（HPLC）.pptVIP

第三章 高效液相色谱分析（HPLC） §3-1高效液相色谱的特点 一、定义：液相色谱法是指流动相为液体的色谱技术。 二、特点 1.高压: 可达150～350×105 Pa 2.高速: 例，分离20种氨基酸，经典色谱法要20多小时，用HPLC只需1小时。 3.高效：3万塔板/米（GC2000塔板/米） 4.高灵敏度： 紫外检测器10-9 g 荧光检测器10-11g 5．高度自动化计算机的应用:使 HPLC 不仅能自动处理数据、绘图和打印分析结果，而且还可以自动控制色谱条件，使色谱系统自始至终都在最佳状态下工作，成为全自动化的仪器。 6．应用范围广（与气相色谱法相比）: HPLC 可用于高沸点、相对分子质量大、热稳定性差的有机化合物及各种离子的分离分析。如氨基酸、蛋白质、生物碱、核酸、甾体、维生素、抗生素等。大约占有机物的70-80%。 7．流动相可选择范围广: 它可用多种溶剂作流动相，通过改变流动相组成来改善分离效果，因此对于性质和结构类似的物质分离的可能性比气相色谱法更大。 8．馏分容易收集 更有利于制备。 §3-2影响色谱峰扩展及色谱分离的因素 一、与GC 比较；基本概念及理论基础与GC一致； 主要区别：流动相为液体。 二、对色谱峰扩展及色谱分离影响的因素： 1.涡流扩散项 ： He = 2λdp 含义同GC法 2.纵向扩散项65/-1： Hd = CdDm/u； 在LC中可略,GC中重要； 3.传质阻力项：a.固定相传质阻力项； b.流动相传质阻力项。 结论：改进固定相就成为提高液相色谱柱效一 个重要问题。 66/-1 综合分析，由于柱内色谱峰扩展所引起的塔板高度的变化可归纳为： H=A+B/u+Cu 形式与GC一致，其主要区别在于扩展项可以忽略，影响柱效的主要因素是传质项。 从3-6式看出，H近似正比于d2p ，所以:减小粒度是提高柱效的最有效途径。 4.其它影响因素68/2； 柱外展宽：指色谱柱外各种因素引起的峰扩展. a.柱前展宽：主要由进样所引起； b.柱后展宽：主要由接管、检测器流通池体积所引起。为此，连接管的体积、检测器的死体积应尽可能小。 HPLC与GC差别 1．分析对象的区别 GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较 低的样品；但对高沸点、挥发性差、 热稳定性差、离子型及高聚物的样 品，尤其对大多数生化样品不可检测 占有机物的20% HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括 有机介质溶液），不受样品挥发性和 热稳定性的限制，对分子量大、难 气化、热稳定性差的生化样品及高分 子和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80% 2．流动相差别的区别 GC：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用 力，只与固定相有相互作用。 HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用 力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起 正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改 变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用，当 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 也可以增大分离选择性。 3．操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小） §3.3高效液相色谱的主要类型及其分离原理 类型：液-液色谱；液-固色谱；离子交换色谱； 离子对色谱；离子色谱；空间排阻色谱 一.液-液分配色谱法及化合键合相色谱 1.特点：a.流动相和固定相都是液体 b.两相应互不相溶，有明显的分界面 2.分离机制：溶质在两相间进行分配 K = cs/cm = kVm/Vs 分离的顺序决定于分配系数的大小，分配系数大的组分保留值大.而且流动相的种类对分配系数有较大的影响。 3.分类： a.正相液-液色谱法（NLLC） ：流动相的极性小于固定液的极性；极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱，适于分离极性组分 b.反相液-液色谱法（RLLC） ：流动相的极性大于固定液的极性；极性大的组分先出柱，极性小的组