抗癌蛋白NOR1基因工程重组蛋白表达条件的优化和纯化.pdfVIP

中南大学学报（医学版） 　２０１１，３６（７）　　ｈｔｔｐ：／／ｘｂｙｘ．ｘｙｓｍ．ｎｅｔ ６１０ ＪＣｅｎｔＳｏｕｔｈＵｎｉｖ（ＭｅｄＳｃｉ） 抗癌蛋白ＮＯＲ１基因工程重组蛋白 表达条件的优化和纯化 １ １ １ １ ２ １ １ １ 向波 ，王理 ，王卫 ，李文娟 ，易梅 ，李小玲 ，曾朝阳 ，李桂源 （中南大学　１．肿瘤研究所，长沙４１００７８；２．湘雅医院皮肤科，长沙４１０００８） ［摘要］　目的：构建ＮＯＲ１基因原核表达载体，并在大肠杆菌中原核表达ＮＯＲ１重组蛋白，对其诱导条件 进行优化，并纯化ＮＯＲ１蛋白。方法：ＰＣＲ扩增人ＮＯＲ１基因全长开放阅读框，克隆入原核表达载体ｐＥＴ２８ｂ。 重组质粒转化大肠杆菌，采用不同温度、不同抗生素浓度、不同ＩＰＴＧ浓度诱导ＮＯＲ１蛋白表达。选择最佳条 件大量诱导ＮＯＲ１蛋白表达，采用ＮｉＩＤＥ树脂纯化ＮＯＲ１重组蛋白，并通过 ＳＤＳＰＡＧＥ凝胶电泳检测重组蛋 白的纯度。结果：成功构建了ｐＥＴ２８ｂＮＯＲ１基因原核表达载体，并转化Ｅ．ｃｏｌｉＲｏｓｅｔｔａｂｌｕｅ（ＤＥ３）。利用ＩＰＴＧ 诱导ＨｉｓＮＯＲ１蛋白表达，结果发现ＩＰＴＧ浓度、温度、抗生素浓度均可影响ＮＯＲ１重组蛋白的表达效率。０．２５ ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ即可诱导ＮＯＲ１融合蛋白的表达，分子质量为４３ｋＤ；随着ＩＰＴＧ浓度提高，重组蛋白表达量增 加。温度对ＮＯＲ１蛋白原核表达有重要影响，低温条件（３０℃）无法诱导ＮＯＲ１蛋白表达。提高卡那霉素筛 选浓度可以提高ＮＯＲ１蛋白表达量。原核表达的ＮＯＲ１重组蛋白绝大部分形成包涵体，采用６ｍｏｌ／Ｌ盐酸胍 溶解包涵体，通过ＮｉＩＤＥ树脂纯化得到高纯度的ＨｉｓＮＯＲ１重组蛋白。结论：构建了ｐＥＴ２８ｂＮＯＲ１原核表达 载体。研究发现在３７℃条件下，采用１ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ，２００ ｇ／ｍＬ卡那霉素可以高效诱导 ＮＯＲ１蛋白表达。 μ 纯化得到高纯度的ＮＯＲ１重组蛋白。 ［关键词］　 鼻咽癌；　ＮＯＲ１；　原核表达；　重组蛋白；　纯化 ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２７３４７．２０１１．０７．００５ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆａｎｔｉｃａｎｃｅｒｐｒｏｔｅｉｎＮＯＲ１ｉｎＥ．ｃｏｌｉ １ １ １ １ ２ １ ＸＩＡＮＧＢｏ，ＷＡＮＧＬｉ，ＷＡＮＧＷｅｉ，ＬＩＷｅｎｊｕａｎ，ＹＩＭｅｉ，ＬＩＸｉａｏｌｉｎｇ， １ １ ＺＥＮＧＺｈａｏｙａｎｇ，ＬＩＧｕｉｙｕａｎ （１．ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＣｅｎｔｒａｌＳｏｕｔｈＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ４１００７８； ２．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＤｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，ＸｉａｎｇｙａＨｏｓｐｉｔａｌ，ＣｅｎｔｒａｌＳｏｕｔｈＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ４１０００８，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　ＴｏｏｐｔｉｍｉｚｅｔｈｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎＮＯＲ１ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎＥ．ｃｏｌｉ．ａｎｄｐｕｒｉｆｙＮＯＲ１ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＡｆｕｌｌｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡｏｆｈｕｍａｎＮＯＲ１