去氧核醣核酸(DNA)萃取與電泳分析基因體電泳分離與觀察.docVIP

去氧核醣核酸(DNA) 萃取與電泳分析 基因體電泳分離與觀察 100年01月06日 學生：林怡汝 指導老師：陳婷婷 江主惠 壹、實習目的 1.由專業老師授課講解，對於生物的基因體DNA進一步的了解。 2.利用植物基因體，來操作萃取與分析。 3.了解遺傳物質DNA的用處與內部構造。 4.知道紫外光對於DNA的作用與其成份構造。 5.了解跑膠的原理與應用。 貳、實習器材 去氧核醣核酸(DNA)萃取與電泳分析↓ 植物組織-葉子 研缽與杵 水浴鍋 冰桶 離心管 離心機 液態氮 無菌水 130μL P溶液 Binding溶液 700μLwash溶液 Spin filter/colmn管子 微量吸管器，3cm ar 1cm and 0.5cm 收集管與吸管 各種容液 研缽與杵 研缽與葉子 水浴鍋 離心機 P溶液ar Binding溶液 and wash溶液 液態氮 基因體電泳分離與觀察↓ 膠體樣品槽 蠟膜 紫外燈 2μL 6X樣品緩衝液 0.5μg/ml溴化乙錠溶液 核酸染料 參、實習步驟 去氧核醣核酸(DNA)萃取與電泳分析↓ 1.將葉子一片放入研缽，倒入液態氮，用杵研磨成細粉，放入離心管內。 2. 放入離心管(含有以下的溶液)後，震盪混合5~10秒，離心5分鐘。 360μL 萃取液A 40μL 4μ 萃取液B LRNaseA溶液 3.離心完，置於65℃水浴鍋中加熱 10~20分鐘，並且不定時將其搖一搖，使其混合均勻。 4.拿出離心管，加入130μLP溶液，上下混合，冰置5分鐘。 5.收集上清液放入spin filter管子內，離心13,000rpm 5分鐘。 6.將收集管中所得的液體，吸出到新的離心管中。 7.加入1.5倍體積的Binding溶液，上下混合。 8.取650μL前面之混合液，加入到spin colmn管子內，離心13,000rpm 1分鐘。 9.離心完後，此時DNA已吸附在spin colmn中，所以將離心下來的收集管內的液體丟掉。 10.加入700μLwash溶液到spin colmn，離心13,000rpm 1分鐘後，將收集管內的液體丟掉。 11.再重複第10的步驟一次。 12.離心13,000rpm 5分鐘後，將spin colmn風乾3分鐘，去除酒精。 13.加入60~70℃無菌水30μL於spin colmn。 14.將其放入水浴鍋中，加熱3分鐘 ，離心13,000rpm 1分鐘，收集管內的DNA存放於-20℃。 基因體電泳分離與觀察↓ 1.取4μL 1KB 標記 DNA 於膠體樣品槽。 2.取2μL DNA 樣品於蠟膜上，加入2μL 6X樣品緩衝液(含色帶與甘油) 混合。 3.放入樣品槽即可進行跑膠。 4.通以100V直流電，DNA會朝向正極移動。 5.依DNA大小而異，一般約色帶至膠體2/3位置，即可終止跑膠。 6.將膠體浸泡於0.5μg/ml溴化乙錠溶液10分鐘。 7.6X凝膠上加入核酸染料 Xylene cyanol Bromophenol blue Glycerol 0.25% 0.25% 30% 8.取出膠體，移入紫外光暗盒中，打開紫外燈，觀察是否有螢光。 去氧核醣核酸(DNA)萃取與電泳分析基因體電泳分離與觀察之操作圖片 1.葉子放入研缽 2.倒入液態氮 3.攪拌 4.攪拌 5.成細粉 6.刮杵上的細粉 7.刮缽上的細粉 8.將細粉放入離心管 9.將細粉放入離心管 10.將細粉放入離心管 11.上下搖晃，使均勻 12. 蓋上蓋子 13. 搖晃均勻後 14. 與各組一起放入海棉上 15. 放於水域鍋內 16. 於65℃加熱 10~20分鐘(拍的時候是64.3℃) 17. 加入130μLP溶液 18. 冰置5分鐘 19離心13,000rpm 5分鐘 20.離心完後 21.插入吸管 22.吸取容液 23.溶液滴入收集管 24.再次離心 25.再次加熱 26. 加入2μL 6X樣品緩衝液 27. 進行跑膠 28. 跑膠 29. 紫外燈下，有3個螢光(2個微弱) 30全體合照 肆、觀察結果與討論 如何測定DNA的濃度與純度？ A:以無菌水做適當稀釋，並且利用吸光值的計算所得到的數字就是了。以1.7~2.0 為標準。 選擇螢光時，以哪一種為重點？ A:有核酸成分，而且要有染料，才可進行分別。 為何要用紫外燈來照射DNA？ A:DNA裡的蛋白質芳香族胺基酸會吸收紫外光。 跑膠的原裡是什麼？ A:使DNA附著在蠟膜上。 色帶的功用是什麼？ A:追蹤DNA的位置，還有避免DNA跑出膠體。 為何要有甘油成分？ A:增加比重，讓樣品沉入樣品槽。 伍、補充 1.植物組織磨的愈細愈佳。 2.倒完液態氮，要趕快磨，不要讓植物