多聚甲醛固定对荧光蛋白分子间FRET效率的影响.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，２９（７）：６２～６７ 多聚甲醛固定对荧光蛋白分子间ＦＲＥＴ 效率的影响 邵红伟　张文峰　胡青莲　沈　晗　吴凤麟　黄树林 （广东药学院生命科学与生物制药学院／生物制药研究所 　广州　５１０００６） 摘要　目的：研究多聚甲醛固定对利用荧光共振能量转移（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｒｅｓｏｎａｎｃｅｅｎｅｒｇｙｔｒａｎｓｆｅｒ， ＦＲＥＴ）检测细胞中蛋白质相互作用的影响，解决运动能力较强的细胞中ＦＲＥＴ效率检测的问题。 方法：选用两个已知能够相互作用的蛋白分子ＴＲＡ和ＴＲＢ，将荧光蛋白ＥＣＦＰ和ＥＹＦＰ的编码基 因通过融合ＰＣＲ分别标记在其 Ｃ端；将两个融合基因共转染靶细胞，一组细胞经低浓度（０．５％） 多聚甲醛短时（０．５～１ｈ）固定，另一组不固定，利用激光共聚焦扫描显微镜检测两个融合蛋白之 间的ＦＲＥＴ效率，比较其在两组细胞之间的差异情况。结果：经过统计学分析，在活细胞和经低浓 度多聚甲醛短时间固定的细胞中，ＥＣＦＰ与ＥＹＦＰ之间的ＦＲＥＴ效率没有显著差异。结论：低浓度 短时间的多聚甲醛固定对于荧光蛋白分子之间的相互作用没有显著的影响，因此对于运动能力 过强的细胞可以固定后再进行ＦＲＥＴ检测。 关键词　ＦＲＥＴ　ＥＣＦＰ／ＥＹＦＰ　固定　多聚甲醛 中图分类号　Ｑ３３１ 　　众所周知，蛋白质是组成细胞的基本分子之一，细 对供体进行激发能够导致受体发射荧光，同时伴随着供 胞的生理功能主要是通过细胞内无数的蛋白质分子之 ［６］ 体发射荧光的损失 。用于进行ＦＲＥＴ研究的荧光基团 间的相互作用来完成的，蛋白质之间的相互作用是细 有很多，其中由ＥＧＦＰ的突变体———青色荧光蛋白 胞机器正常运转所必不可少的，因此研究蛋白质分子 （ｅｎｈａｎｃｅｄｃｙａｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＥＣＦＰ）和黄色荧光蛋 间的相互作用是研究蛋白质功能的重要手段之一。目 白（ｅｎｈａｎｃｅｄｙｅｌｌｏｗｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＥＹＦＰ）组成的供 前研究蛋白质相互作用的方法有很多，包括酵母双杂 体受体对是研究中经常用到的，这是因为ＥＣＦＰ的发射 ? 交、免疫共沉淀（ＣｏＩｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ，ＣｏＩＰ）、Ｐｕｌｌ ? ? ? 光谱（Ｅｍｉｓｓｉｏｎｓｐｅｃｔｒａ）和ＥＹＦＰ的吸收光谱（Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｄｏｗｎ、表面展示技术、荧光共振能量转移（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒａ）具有很大的重叠部分，两者的光谱串扰（ｓｐｅｃｔｒａｌ ｒｅｓｏｎａｎｃｅｅｎｅｒｇｙｔｒａｎｓｆｅｒ，ＦＲＥＴ）等。其中ＦＲＥＴ技术 ｂｌｅｅｄｔｈｒｏｕｇｈ，ＳＢＴ）也比较少，并且两者都是单体荧光分 能够实时、精确地分析活细胞内特定蛋白质分子之间 ［７］ 子 。用于ＦＲＥＴ分析的方法也有很多种，比较常用的 的相互作用，具有其他方法不可比拟的优势，因此得到 有敏化发射光谱法（ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄｅｍｉｓｓｉｏｎ，ＳＥ）和受体漂白 ［１～５］ 了越来越广泛的应用 。 ［８］ ａｃｃｅｐｔｏｒｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ，ＡＢ） 。 法（ ? 　　ＦＲＥＴ是指两个荧光基团在足够接近（＜１００?）并