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荧光共振能量转移 （FRET ）技术在生物研究中的应用 高裕锋 分析化学 B200425012 摘要：简要综述了荧光共振能量转移 （FRET ）技术在生物研究中的一些应用。核酸的结构、 DNA 测序、核酸杂交、蛋白质结构和蛋白质相互作用等的研究是生命科学研究重要 组成部分，相关工作一直备受关注，而FRET 技术被广泛应用于相关领域研究 ，并 取得了较突出的结果。 关键词：荧光共振能量转移 （FRET ），核酸结构，DNA 测序，核酸杂交，蛋白质结构，蛋 白质相互作用。 生命科学被誉为21 世纪的科学，为了揭示生命的奥妙，人们投入了大量的工作。其 对于核酸和蛋白质的研究备受关注，大量的新技术与新方法被用于该领域的研究 。荧光共 振能量转移技术是一项经典的荧光技术，但是随着荧光成像技术的发展，二者相互结合，成 为了生命科学领域的一个重要研究手段[1,2] 。本文简单介绍了基于 FRET 原理的新技术在生 物研究中的一些应用。 一、FRET 基本原理[3] FRET 现象是Perrin 在20 世纪初首先发现的，1948 年，Foster[4,5]创立了理论原理。FRET 指荧光能量给体与受体间通过偶极－偶极耦合作用以非辐射方式转移能量的过程，又称为长 距离能量转移。产生FRET 的条件（图1）主要有三个：（1）给体与受体间在合适的距离（1～ 10 nm）；（2 ）给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠，这是能量匹配的条件；（3 ） 给体与受体的偶极具一定的空间取向，这是偶极－偶极耦合作用的条件。 图1 产生FRET 条件示意图 FRET 的效率用E表示，E用式 （1）计算：其 R 为Foster距离，表示某一给定给体与受 0 R 6 E = 0 （1） R 6 + R 6 0 R = const ⋅κ 2 ⋅ n−4 ⋅φ ⋅ J （2 ） 0 D DA 体间能量转移效率为50 ％时的距离；R为给体与受体的实际距离。R 可由式 （2 ）计算：其 0 κ2 是方向因素,n是溶剂的反射系数,φD是供体探针结合到蛋白的量子效率, J DA是供体发 射波长和受体吸收波长的交叠系数。由式（2）可看出R 对于给定的给－受体是一个特征值， 0 因此，式（1） E值与R 的关系紧密，这也成为了FRET用于测定分子间或基团间距离的重 要理论依据。 E值可由以下几种方式测定：用荧光强度表征 （E=1- IDA/ ID ，IDA表示A存在时D 的荧光 强度）；用量子产率表征 （E=1- φ / φ ）；用荧光寿命表征 （E=1- τ / τ）。这表示研 DA D DA D 究FRET可以通过不同的实验设备，既可以用普通光谱仪测定其荧光强度、量子产率，也可 以用时间分辨仪测定其荧光寿命。随着成像技术的发展，用显微成像的方法可更直观地观测 FRET地发生。 二、FRET探针 FRET需要两个探针，即荧光给体与荧光受体，要求是给体的发射光谱与受体的吸收光 谱有一定交叠，而与受体的发射光谱尽量无交叠。常用的探针主要有三种：荧光蛋白、传统 有机染料和镧系染料。 [6] 荧光蛋白 是一类能发射荧光的天然蛋白及其突变体，常见的有绿色荧光蛋白（GFP ）、 蓝色荧光蛋白 （BFP ）、青