家蚕碱性磷酸酶的分离纯化与部分性质.pdfVIP

维普资讯 第 3O卷 第 5期 西 南 师 范 大 学 学 报 (自然科 学版 ) 2005年 10月 Vo1．3O NO． 5 JournalofSouthwestChinaNormalUniversity(NaturalScience) oet． 2005 文章编号 ：1000—5471I2005)05～0930—05 家蚕碱性磷酸酶的分离纯化与部分性质 李长春 ， 罗 英 ， 鲁 成 ， 唐云 明 1．西南大学 生命科学学院，重庆 400715；2．西南大学 蚕桑学农业部重点实验室，重庆 400716 摘要 ：经 lO ～5O 硫酸铵分级沉淀分离 ，DEAE—Sepharose离子交换柱层析 ．SephacrylS-200凝胶过滤纯化 ，从 家蚕 (Bombyxrnori)肠液 中分离纯化出电泳纯 的碱性磷酸酶、该酶提纯倍数为 464倍 ，比活力为3936U／mg、酶学 性质和动力学性质研究表明，该酶催化磷酸苯二钠 的水解反应 ，最适 pH值为 10、5，pH 小于7．5和大于 11均不稳 定 ；最适温度为 4O℃，温度高于 5O℃不稳定 ；米 氏常数 Km值为 1．25mmol／L． 关 键 词 ：家蚕 ；碱性磷酸酶 ；分离纯化 中图分类号：Q946．5 文献标识码 ：A 碱性磷酸酶 (alkalinephosphatase，AKP)在生物界的各生物体内分布很广 ，动物 、植物、微生物 中均 广泛存在．提纯的AKP常被应用于对核酸 、毒物学、医学等的研究 ，分析 、测定核苷酸顺序及其基因的重 组 、分离，是基因工程 、遗传工程常用的工具酶，也是酶联免疫测定技术的常用工具酶之一 ．添加 AKP 的化妆品有益于皮肤细胞的再生和新陈代谢 ；人类血清中的AKP在不 同疾病状态下有着显著变化 ，临床 上将血清 AKP变化指标作为诊断某些疾病的依据．目前对于细菌和高等动物的AKP已有广泛 的研究，但 对鳞翅 目类昆虫的AKP则研究报道较少．我们以家蚕 (Bombyxmori)为材料 ，通过家蚕品种筛选 ，从中选 出了AKP活性极高的品种．为了提高家蚕品种的附加产值 ，提升家蚕的经济价值 ，我们对家蚕高 AKP活 性品种的肠液的AKP高效分离纯化和基本性质进行 了研究 ，以期为家蚕 AKP的开发应用奠定基础． 1 材料与方法 1．1 材 料 在选择实验材料之前 ，我们对家蚕基因库中的 100多个品种进行 了AKP活性测定和 AKP同工酶电泳 分析．实验用家蚕 (Bombyxmori)品种为 pMy000，5龄第 4天 ，由西南大学蚕桑学农业部重点实验室家蚕 基因库提供． 1．2 酶活力 的测定 采用磷酸苯二钠为底物的金氏法 。酶活力单位定义：1mL，0．1mol／I的碳酸盐缓冲液 (pH 10-O)，加 入 1mL0．01mol／I的磷酸苯二钠 ，37℃预热 5min，然后加入 0．1mL酶液 ，混匀后于 37℃保温 15min， 再加入 3mL铁氢化钾，最后测定 510nm处的光吸收值 ，以每分钟产生 lt,mol酚所需的酶量定义为一个 活力单位 (L ． 1．3 蛋 白质浓度 的 定 在 S一200层析之fj。 』1】紫外分光光度法测定蛋白质浓度 。；在 S一200层析及其之后采用 Bradford法测 收稿 日期 ：2OO4—12—02 基金项 目 重庆市科委资助项 目(2OO3—7852)、 作者简介 李长春 (1979一)，男 ．四JIl患县人 ，硕士研究生 ，主要从事酶与酶工程的研究． 通讯作者 ：唐云明 ，教授、 维普资讯 第 5期 李长春 ，等：家蚕碱性磷酸酶的分离纯化与部分性质 931 定蛋 白质浓度 ，以牛血清 白蛋 白为标准品． 1．4 酶的分离纯化 1．4．1 粗酶液 的提取 取 5龄第 4天家蚕的肠液作为提取 AKP的样品 ，用预冷的 0．05mol／L的 Tris—HC1缓冲液 (