人子宫内膜癌细胞系的建立及其特异性结合短肽的筛选.pdfVIP

目 录 中文摘要 1 英文摘要 3 前言 5 材料与试剂 13 一、主要实验材料及试 剂13 二、主要试剂的配置方 法14 三、主要实验仪器及设 备19 技术路线 21 第一部分 22 一、实验方 法 22 二、实验结 果 23 三、讨 论 25 第二部分 28 一、实验方 法 28 二、实验结果及讨 论 31 三、结 论 35 第三部分 37 一、实验方 法 41 二、实验结 果 43 三、讨 论 46 第四部分 52 一、实验方 法 53 二、实验结 果 58 三、讨 论 70 结论 77 参考文献 78 附录 88 缩略词 92 研究生在读期间发表的文章94 致谢 95 人子宫内膜腺癌细胞系 EAC 的建立及其特异性结合短肽的筛选和分析 中文摘要 目的：建立人子宫内膜腺癌细胞系EAC ，检测其生物学特性和可能肿瘤标志物， 为子宫内膜癌的基础和临床研究提供了良好的材料。并利用噬菌体随机十二肽库 筛选出能够和子宫内膜腺癌细胞系EAC 的特异性结合的短肽序列，分析序列组 成，找出能够和子宫内膜腺癌细胞特异性结合的配体蛋白质及分析这些蛋白与细 胞结合的氨基酸决定簇位点及方式，为研究短肽在肿瘤靶向药物开发和肿瘤特异 性定位标志方面提供研究资料。 方法：将人子宫内膜腺癌组织块接种于裸鼠背部皮下，待裸鼠成瘤后将移植瘤做 原代培养，稳定传代后，对其细胞形态，超微结构，生长曲线，致瘤率，染色体， 及雌孕激素受体进行观察检测，并用RT-PCR 技术在mRNA 水平检测了PTEN 基因的转录水平和PCR 产物测序，及用免疫组化和Western blot 方法在蛋白质表 达水平检测了VEGF 的表达水平。并用噬菌体随机十二肽库对体外培养的人子 宫内膜癌细胞EAC 进行5 轮全细胞筛选。在五轮细胞筛选后的两部分噬菌体库 中，即细胞表面结合部分和内化入细胞部分，分别随机挑选18 个以上噬菌体单 克隆进行测序。同时对随机挑选的噬菌体单克隆进行与野生型VcsM13 噬菌体的 竞争结合实验及对HepG-2 、MCF-7 、JEC 、SWO38、NCI-H460 ，HLO2 六种人 类不同组织来源细胞系的特异性结合分析，在测序结果中找出及分析出现频率高 的短肽序列和其可能的蛋白质结构。 结果：EAC 细胞系目前已传代61 代，同时液氮保种，复苏良好。该细胞系生长 快，稳定传代，形态学特征符合腺上皮恶性肿瘤细胞特征。染色体检查为超二倍 体。雌孕激素受体检查阴性。致瘤率100%，移植瘤病理学特征与原细胞系相似。 EAC 细胞中的PTEN mRNA 水平高于正常，测序结果显示转录水平未见突变。 VEGF蛋白表达水平高。经过噬菌体5 轮全细胞筛选后，各部分噬菌体库的回收 5 6 量均可达到10 ～10 数量级，且竞争结合分析及细胞特异性结合分析均显示筛选 后的噬菌体克隆及噬菌体库对子宫内膜癌细胞具有明显的特异性结合。测序结果 显示有一条序列出现频率较高，序列-SNPTTPDHLWRG- 在表面结合和内化释放 1 人子宫内膜腺癌细胞系 EAC 的建立及其特异性结合短肽的筛选和分析 的噬菌体中高频出现。 结论：成功建立了一株新的人子宫内膜腺癌细胞系，该细胞系能高表达 VEGF ， 未发现有PTEN 突变, 为开展人类子宫内膜癌基础和临床研究提供了理想实用的 模型。利用噬菌体肽库对 EAC 细胞系进行全细胞筛选可得到与肿瘤细胞能特异 性结合的短肽序列，这些短肽片段可能为与肿瘤细胞表面特异及过度表达的一些 受体相结合的配体蛋白上的决定簇序列，并可能