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王波博士论文 HCMV 临床病毒株的分离及其特定基因结构分析和表达研究 HCMV临床病毒株的分离及其特定基因结构分析和表达研究 中文摘要 目的： 1.分离广州地区围产新生儿感染的人巨细胞病毒（Human Cytomegalovirus，HCMV ）临床病毒株；2.研究这些低传代 HCMV 临床病毒 株基因组中的特有基因UL136～UL148的结构,分析其结构多态性与HCMV先天 性感染致病的关系;3.研究 HCMV 临床毒株特有基因的表达情况，探讨这些基 因编码产物的功能，揭示它们在先天性 HCMV 感染的致病机制中可能的作用。 试图通过这些研究为临床低传代HCMV 临床致病机制的研究奠定基础。 方法：1.从广州地区先天性感染 HCMV的新生儿尿液中分离野生型HCMV病毒， 获取病毒 DNA 和 RNA；2.根据 GenBank 公布的 HCMV 低传代毒株 Toledo 的 UL136-UL148 等13个基因全序列及有关文献，应用 PCR 技术扩增这些特有基 因片段；3.应用基因克隆技术构建这些特有基因的重组质粒；4.对重组体进 行测序；5.应用生物信息学方法分析这些基因结构、及其编码蛋白质的多态 性；6.应用 RT-PCR 技术检测上述基因 mRNA 的表达情况；7.并分析其编码产 物的基本性质和特征。 结果：1.成功分离获得 4株HCMV 临床低传代病毒株：HCMV D3、D2、D52、C30； 2.以HCMV D3 临床毒株为研究主体，应用 PCR 技术成功扩增出UL136～UL148 特有区域的全部13个基因，同时扩增其他临床毒株的相应基因，获得上述毒 株的13个特有基因的总共32个全基因序列；3.克隆测序，序列呈报GenBank, 收录序列号为：DQ180354～DQ180391；4.对临床毒株的这些基因及其编码的 蛋白质进行同源性比较分析，发现大部分基因较为保守，具有相对稳定的序 列，同时又具有较为丰富的多态性；5.从 C30 野生毒株中能检测到 UL137、 UL142、UL144、UL145和UL148 等5个基因存在mRNA水平的表达。 结论：1.广州地区围产新生儿感染 HCMV 的临床毒株基因组中,存在着实验病 毒株所缺失的 UL136～UL148 等 13 个独特基因结构，并且具有较为丰富的多 态性。2.本研究初步证实了其中 UL137、UL142、UL144、UL145、UL148 等 5 1 王波博士论文 HCMV 临床病毒株的分离及其特定基因结构分析和表达研究 个特有基因存在 mRNA 水平表达。3.结果显示，野生型 HCMV 临床毒株中 UL136～UL148 等13个独特基因，不影响 HCMV 病毒的生长和繁殖，但可能与 病毒的临床致病有密切关系；4.结果还显示，这些特有基因具备丰富的结构 多态性，可能与它们不同的致病倾向有关；5.其中 UL137、UL142、UL144、 UL145、UL148 等 5 个特有基因存在的 mRNA 水平表达，更高度提示这 5 个基 因可能在HCMV 的致病机制中具有极其重要的功能。 本研究创新点： 1. 首次分离广州地区新生儿感染HCMV 野生病毒株，并研究 这些临床毒株基因结构与表达；2.直接研究低传代的野生临床毒株，避免病 毒株在实验室传代过程中的基因变异和丢失，相对于目前世界上大部分以实 验室缺陷病毒株 AD169 作为研究对象，具有独特的研究价值；3.首次证实了 广州地区野生型 HCMV 毒株结构具备 UL136-UL148 等 13 个独特基因结构，并 UL136-UL148等基因可能在HCMV 且具有较为丰富的多态性，提示野生型 HCMV 感染中发挥作用；4.广州地区 HCMV 临床毒株特有基因共 32 个序列首次被 GenBank收录；5.首次证实了HCMV UL137、UL142、UL144、UL145、UL148等 5个 ORF存在mRNA水平的表达