成骨细胞与骨髓基质细胞共培养 体外骨形成的实验研究.pdfVIP

成骨细胞与 BMSCs 共培养体外骨形成的实验研究 摘 要 目的： 为骨组织工程种子细胞的来源选择提供新的思路。 1. 探讨在不使用细胞因子或化学药物的情况下，成骨细胞提供的成骨微环境能 否在体外诱导骨髓基质细胞(Bone Marrow Stromal Cells BMSCs) 向成骨细胞分 化并形成成熟的骨组织。 2. 成骨细胞在混合细胞中的比例至少达多少时已有较为肯定的成骨效果。 方法： 1. 改进酶消化法结合反复贴壁法培养 1d 龄 SD 乳鼠的成骨细胞。 2 ．形态学观察结合ALP 染色、钙结节染色﹑Ι型胶原染色等检测手段对成骨细 胞进行鉴定。 3. 运用全骨髓贴壁法分离培养 4 w 龄 SD 大鼠的 BMSCs 。 4. BMSCs 的鉴定：形态学观察；流式细胞法检测表面抗原﹑细胞周期和细胞活 力。 5. 将成骨细胞和 BMSCs 以 1 ∶9、2 ∶8、3 ∶7、1 ∶0 的不同比例进行混合培养， 通过测定 3、6、9d 培养液上清中的 ALP 的含量，研究成骨细胞促 BMSCs 有效成骨的最小浓度比。 6 ．相分离法结合冷冻干燥法制作涂敷Ι型胶原的壳聚糖支架材料，并进行扫描 电镜的观察。 7 ．将第三代的成骨细胞、BMSCs 种植到壳聚糖支架材料上，研究两种细胞与材 料的相容性并比较其增殖能力。 8．以有效成骨的最小浓度比混匀成骨细胞与BMSCs ，以5.0 ×107/ ml 的终浓 度接种于 I 型胶原修饰后的壳聚糖支架材料(直径 9 mm ,高 3 mm) 作为共培 养组，相同终浓度的单纯成骨细胞和单纯BMSCs 分别接种于相同支架作为阳 性对照及阴性对照，1.0 ×107/ ml (相当于共培养组中成骨细胞数) 的单纯 成骨细胞接种作为低浓度成骨细胞对照。每组各接种6 例标本，每例接种细 胞悬液 200μl 。全部标本均于体外培养 8 周后取材，通过大体观察、组织 学及免疫组织化学等相关检测对新生骨进行评价。 I 成骨细胞与 BMSCs 共培养体外骨形成的实验研究 结果： 1．改进酶消化法结合反复贴壁法成功培养出成骨细胞。形态学观察具有成骨细 胞的典型形态学特征；ALP ﹑钙结节﹑Ι型胶原染色为阳性。 2 ．贴壁生长法成功培养出BMSCs 。形态学观察具有BMSCs 的典型形态学特征； 表达 CD29﹑CD44，不表达 CD34 和 CD45 ；细胞活力为 81.21%，G0-G1 细 胞占 90.07% 。 3 ．成骨细胞和BMSCs 以3 ∶7 的比例进行混合培养时已可实现有效成骨。 4. 相分离法结合冷冻干燥法制作的壳聚糖支架材料，具有良好的三维立体结构。 孔隙率为 90%，孔径大小平均为 100 μm ，I 型胶原涂敷均匀，是理想的支架 材料之一。 5 ．成骨细胞、BMSCs 均与材料支架黏附良好。两者在支架上的增殖能力无明显 差别。 6. 3 ∶7 比例的共培养组及阳性对照组(成骨细胞组) 体外培养8周后均形成了较 成熟的骨组织，并基本保持了复合物初始的大小和形状。两组新生组织外观及 组织学特征基本相同，免疫组织化学也显示两组均表达骨特异性细胞外基质I 型胶原。阴性对照组(单纯BMSCs组) 在体外培养过程中逐渐皱缩变形，未发现 骨样组织形成。低浓度成骨细胞组在体外培养过程中也出现了明显的皱缩变形, 组织学显示只在局部形成了不连续的骨组织 结论： 1. 在不使用细胞因子或化学药物的情况下，成骨细胞提供的成骨微环境能够在 体外诱导 BMSCs 向成骨细胞分化并形成成熟的骨组织。 2. 混合细胞中成骨细胞与 BMSCs 的比例为 3 ∶7 时是有效成骨的最小浓度比。 关键词： 骨髓基质细胞；成骨细胞；共培养；骨形成 II 成骨细胞与 BMSCs 共培养体外骨形成的实验研究 ABSTRACT Objective: This study explored the feasibi