构建组织工程骨软骨复合体修复软骨及软骨下骨缺损的实验研究.pdfVIP

摘 要 目的： 探讨以骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs ）诱导成 的软骨细胞与纳米羟基磷灰石/ 壳聚糖支架（nano-hydroxyapatite/chitosan scaffold ， nano-HA/CS scaffold ）构建组织工程骨软骨复合体，修复兔膝关节软骨及软骨下骨缺 损的方法及结果，初步评价通过构建组织工程骨软骨复合体修复动物体内骨软骨缺损 这一新方法的价值。 方法： 1、运用密度梯度离心法分离、培养兔BMSCs 。 2 、BMSCs 的鉴定：形态学观察；流式细胞法观察BMSCs 的表面抗原﹑细胞周期和 细胞活力。 3、用特定诱导液将 BMSCs 向成软骨细胞定向诱导分化，通过形态学观察和甲苯胺 蓝等进行分析鉴定。 4 、通过原位复合和冷冻干燥相结合的方法制备 nano-HA/CS 支架，并进行扫描电镜 观察。 5、把软骨细胞与nano-HA/CS 支架的复合、穿“靴”培养，进行扫描电镜观察。 6、把组织工程骨软骨复合体植入到兔膝关节骨软骨缺损中，分别于术后第4 、12 周 取材，通过大体观察和组织学检查等评价修复缺损情况。 结果： 1、密度梯度离心法能获得兔BMSCs ，可在体外分离扩增。 2 、经流式细胞仪分析，BMSCs 的细胞表明抗原 CD29 表达为 91.05%，CD44 表达 为 91.02%，CD34 表达为 0.21%，CD45 表达为 0.10% ；细胞活力为 95.27%，G0-G1 细胞占 94.68% 。BMSCs 形态为长梭形。 3、特定诱导液诱导后 BMSCs 的细胞形态发生变化，由梭形向椭圆形及三角形分化， 甲苯胺蓝染色为阳性。 4 、扫描电镜下观察nano-HA/CS 支架具有多孔结构；测得的支架孔隙率为 90%，孔 径在 50~200 μｍ，平均为150 μm 。 I 5、扫描电镜观察软骨细胞可在nano-HA/CS上较好的粘附生长；复合14天时没被 “靴”隔绝培养基的支架底部空隙深处也有细胞分布，而被“靴”隔绝培养基 的支架顶部只有少量细胞黏附。 6、经术后4周、12周观察和组织学评分，复合体修复缺损处有骨组织和软骨组织 形成，成骨区和成软骨区界面耦合情况实验组明显优于对照组。 结论： 1、密度梯度离心法可获得兔BMSCs ，它可在体外长期、稳定培养，是理想的组织 工程种子细胞。 2 、BMSCs 在特定诱导液内可向软骨定向分化。 3、nano-HA/CS 支架具有较好的细胞相容性。 4 、经穿“靴”结构构建的组织工程化骨软骨复合体可修复兔软骨及软骨下骨缺损。 关键词：骨髓间充质干细胞，纳米羟基磷灰石/壳聚糖支架，穿“靴”结构，骨软 骨复合体，骨软骨缺损 II ABSTRACT Objective To explore the method and the result of repairing osteochondral defect of rabbits with tissue-engineered osteochondral graft composited by chondrocyte and nano-hydroxyapatite/chitosan (nano-HA/CS) scaffold and evaluate a new method to construct the tissue engineered osteochondral composite. Methods 1. BMSCs were isolated from New Zealand rabbits through density-gradient centrifugation and cultured. 2. Id