猪乙脑病毒RTPCR荧光定量PCR及多重RTPCR诊断方法建立.pdfVIP

目 录 中文摘要……………………………………………………………………………………………1 文献综述……………………………………………………………………………………………3 引言……………………………………………………………………………………………… 17 试验一 应用 RT-PCR 方法检测猪乙脑病毒的研究 1 材料与方法…………………………………………………………………………………… 18 2 结果 ………………………………………………………………………………………… 19 3 分析讨论……………………………………………………………………………………… 22 试验二 实时荧光定量 PCR 检测猪乙脑病毒的研究 1 材料与方法…………………………………………………………………………………… 24 2 结果 ………………………………………………………………………………………… 30 3 分析讨论……………………………………………………………………………………… 36 试验三 复合 RT-PCR 检测猪乙脑病毒和猪流感病毒的研究 1 材料与方法…………………………………………………………………………………… 37 2 结果 ………………………………………………………………………………………… 49 3 分析讨论……………………………………………………………………………………… 42 试验四 多重 RT-PCR 检测猪乙脑病毒、猪流感病毒和猪呼吸与繁殖障碍综合征的研究 1 材料与方法…………………………………………………………………………………… 43 2 结果 ………………………………………………………………………………………… 45 3 分析讨论……………………………………………………………………………………… 49 参考文献………………………………………………………………………………………… 51 英文摘要………………………………………………………………………………………… 57 致谢……………………………………………………………………………………………… 59 摘 要 猪乙型脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus，JEV）是二十世纪二十年代被发现并 能引起母猪繁殖障碍的主要病原体之一，其特征是孕前期受到感染后，经胎盘使胚胎或胎儿 受到侵袭，引起母猪流产、胚胎死亡、胎儿畸形、胎儿木乃伊化及不孕等，此外还可以引起 公猪单侧或两侧性睾丸肿大，局部发热，有痛感，数天后，睾丸肿胀消退，逐渐萎缩变硬， 造成精液品质不良，不能配种，同时还可以引起仔猪的皮炎水肿，其它类型的猪感染后无明 显临床特征。猪乙型脑炎病毒病存在于世界各地并在大多数猪场流行，严重影响着养猪业的 发展，因此本病一直是猪病研究的热点之一，JEV 又常同猪伪狂犬病毒、细小病毒、圆环病 毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒等混合感染而加重了其危害。近年来，JEV 感染呈扩大上 升的趋势，给全球养猪业带来巨大的经济损失。所以，加强对 JEV 的检测、监测及预防十分 紧迫。 目前，猪乙型脑炎病毒病诊断方法主要有：病毒分离、血凝抑制试验和乳胶凝集试验等 检测方法，其中血凝抑制试验相对简便，但由于要制备豚鼠红细胞以及被检血清必须经高岭 土或其它方法处理而显得麻烦；乳胶凝集试验的灵敏度不高，尤其是对隐性感染动物往往漏 检；病毒分离和鉴定结果准确可靠，但是该方法费时费力，并且需要一定的技术条件和设备； 聚合酶链式反应(PCR)及荧光定量 PCR 诊断具有灵敏度高、特异性强、快速、简便等优点成 为诊断猪乙脑病毒的研究热点。为此，我们进行了以下研究： （一）根据已报道的JEV基因组序列，设计并合成了1对寡核苷酸引物，通过优化RT-PCR 的条件，成功地从 JEV感染的细胞中扩增出 349 bp 片段，回收 PCR 产物测序，回收该片段， 连接到载体上，并用 EcoRⅠ进行酶切，得到 3015 bp、349 bp 的两条带，与预期的结果相 符合，证实了该扩增片段的特异性，并对 PRRSV cDNA 、SIV cDNA 和正常PK-15 细胞基因组 cDNA的 RT-PCR 扩增均为阴性，证明了 RT-PCR 检测方法的特异性。RT-PCR 检测 JEV cDNA 的 最小检测量为 10 fg。 （二）设计并合成引物和相对应的探针，从 JEV 感染的细胞中提取 RNA，反转录后经 PCR 扩增，