大肠杆菌e. coli hb101 (pbr322) 高密度培育过程质粒的稳定性.pdfVIP

第1卷 第2 期 过 程 工 程 学 报 Vol.1 No.2 2001 年 4 月 The Chinese Journal of Process Engineering Apr. 2001 大肠杆菌E.coli HB101(pBR322) 高密度培养过程质粒的稳定性 1 2 3 3 喻国策 ， 焦瑞身 ， 王骥程 ， 王树青 （1. 中科院化工冶金研究所生化工程国家重点实验室，北京 100080 ；2. 中科院上海植物生理研究所，上海 200032 ； 3. 浙江大学工业过程控制研究所，浙江 杭州 310027 ） 摘 要: 通过正交实验考察了大肠杆菌E.coli HB 101(pBR322)高密度培养过程中，不同培养条件对 o 质粒的稳定性和β−内酰胺酶活力的影响. 结果表明，当温度在 33∼39 C、pH 为 6.4∼7.2、DO 为 40%∼80%、 补料速率在5.4∼10.8 g/h 范围内变化，以及细胞密度达到27.3 g/L、比生长速率达到 0.73 h−1 时，质粒没有发生丢失现象，但在培养过程中β−内酰胺酶的活力降低. 关键词: 大肠杆菌E.coli HB 101(pBR322); 高密度培养; 质粒稳定性; β−内酰胺酶 中图分类号: TQ920.1 文献标识码: A 文章编号: 1009−606X(2001)02−0185−04 1 前 言 基因工程菌在发酵过程中重组质粒可能会表现出一定的不稳定性，将导致得不到预期的目的 基因产物及产量. 质粒的不稳定分为DNA 片段发生重组、缺失或插入的结构性不稳定和细胞分裂 时质粒未进入子细胞的分离性不稳定[1, 2] . 质粒的稳定性受到宿主和质粒的基因型、宿主和质粒的 相互作用、基因表达程度、培养温度、营养限制和反应器操作方式等多种遗传和环境因素的影响[2]. 基因工程菌发酵通常需要高密度菌体培养, 考察某些基因产物的表达情况可以了解高密度培 养条件下产物表达所受的影响. 考察高密度培养过程质粒稳定性的文献不多[3, 4] . 质粒 pBR322 是 基因工程中基本的载体，β−内酰胺酶由质粒pBR322 上的amp(氨苄青霉素)抗性基因编码，利用 宿主细胞的转录翻译系统得以表达. 本工作采用发酵罐分批补料培养方式进行大肠杆菌 E. coli HB 101(pBR322) 的高密度培养，考察了多种培养条件下质粒稳定性和β−内酰胺酶酶活性变化情况. 2 材料与方法 2.1 菌株和培养基 大肠杆菌E. coli HB 101(pBR322) 由中科院上海植物生理研究所微生物代谢调节室保藏. 培养 基选用TB 培养基(g/L): 蛋白胨12，酵母膏24 ，甘油4.0 ，缓冲液KH PO 2.3 ，K HPO 12.5, 另 2 4 2 4 外补充葡萄糖5 g/L. 培养基中葡萄糖、缓冲液和其余部分分开灭菌后再混合. 2.2 培养系统 采用NBS 公司BIOFLOII 5 L 发酵罐系统, 可实现温度、pH 、搅拌转速和DO 以及补料速率 的设定值控制. 记录仪(µR 100, YOKOGAWA)可显示温度、pH 和DO 的数值并打印输出. 2.3 正交实验设计 温度、pH 及DO 和碳源浓度是培养过程中比较重要的几个因素，安排以温度、pH 、DO 及补 料速率为考察因素的四因素三水平正交实验即L9 (34) (见表1). pH 和温度水平范围的选择是根据 文献[5, 6]中对pH 和温度的控制情