高效表达Smad2蛋白的A549细胞模型的建立.pdfVIP

浙江理工大学学报，第30卷，第3期，2013年5月 Journalof Sci—Tech Zhejiang University 2013 V01．30，No．3，May 文章编号：1673—3851(2013)03—0372—05 袁素敬1，梁余培1，陈勇毅1，章康健2 (1．浙江理工大学生命科学学院新元医学与生物技术研究所，杭州310018； 2．中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，上海200031) 摘要：将携带Smad2一Flag基因的慢病毒包装系列质粒转染293T细胞，进行慢病毒包装。用收集并纯化好的 慢病毒感染A549细胞，流式分选筛选出GFP阳性的细胞，用Flag抗体和Smad2抗体进行Westernblot鉴定。流式 分选得到的GFP阳性的A549细胞经Westernblot鉴定能高效表达外源Smad2一Flag融合蛋白，同时空载慢病毒处 步研究超级干扰素抗肺癌的分子机制奠定了基础。 关键词：A549细胞株；慢病毒；GFP；Smad2 中图分类号：Q507 文献标志码：A EMT的发生[9q3|。 0引言 或者肿瘤侵袭时由宿主细胞产生的一类糖蛋白类细 转化生长因子(TGF-t3)家族分为两个亚类：骨 胞因子，干扰素的产生可以激活细胞的免疫系统产 形态发生蛋白BMP和转化生长因子TGF-13亚类， 其中部分蛋白只在特定的细胞或胚胎发育的特定时 生防御机制从而清除病原体或者肿瘤。基于受体的 期表达，如GDF8和Myostatin；而部分蛋白则在胚不同，可以将干扰素分为三大类：I型干扰素如 胎发育过程中和成体组织中广泛表达，如TGF-t31 和BMP4，这些因子相互协作，在调控细胞的生长、 分化、凋亡、迁移和细胞外基质形成的过程中起着重 扰素主要用于抗病毒治疗，但其临床直接抗癌效果 并不显著，并且干扰素直接调节癌症信号机理研究相 要的作用。TGF-p信号的起始是通过配体招募并 激活受体丝氨酸／苏氨酸激酶，磷酸化R-Smad对其抗病毒机制研究较少。干扰素抗癌信号通路与 (Smadl，2，3，5，8)，活化的R—Smad与Co-Smad (Smad4)结合形成Smads复合体，将信号传递到细 胞核内。在细胞核内，活化的Smads复合体再与相 关的转录因子相互作用调控下游靶基因的表达[1]。 越来越多的研究表明TGFB／Smad2信号通路与肿一步研究超级干扰素的抗癌机理。 瘤发生密切相关，几乎所有的乳腺癌和结肠癌细胞 超级干扰素(Super 中都发现有该通路成员的突变[2巧]，前列腺癌细胞中 具有自主知识产权的新型基因工程干扰素，由四川 也普遍存在TGFl3信号通路的激活[6。8]。另有研究辉阳生命工程股份有限公司与中科院刘新垣院士共 表明，TGFl3／Smad2信号通路的激活可以促进同研发而成，它与Amgeng公司的一种已经下市的 收稿Et期：2012--04—25 基金项目：浙江理工大学科研启动基金(1116818一Y) 作者简介：袁素敬(1985一)，女，河北沧州人，硕士研究生，研究方向为超级干扰素抗癌机制研究。 通信作者：章康健，电子邮箱：zhangkangjian@sibcb．ac．cn 万方数据 第3期 袁素敬等：高效表达SrIlad2蛋白的A549细胞模型的建立 干扰素(干复津)的氨基酸序列一致，但碱基序列不 同，由于采用了全新的生物技术工艺，使其蛋白质空 TGAA。 间构象发生了改变，令其具有更强的抗病毒作用及 PCR反应体系详见表1。 极低副作用，其抗病毒实验已经进入临床III期，同 表1 PCR反应体系 时临床抗癌小样本实验发现该干扰素有显著的直接 Component Volu