基于胞内cAMP浓度测定融合蛋白GGH活性的改良方法.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３３（１１）：６３６７ 基于胞内ｃＡＭＰ浓度测定融合蛋白ＧＧＨ 活性的改良方法 耿　燕　任怡琳　许正宏　窦文芳 （江南大学药学院　无锡　２１４１２２２） 摘要　目的：改良一种基于胞内ｃＡＭＰ浓度变化，用于融合蛋白ＧＧＨ生物学活性测定的方法。方 法：根据融合蛋白ＧＧＨ是 ＧＬＰ１类似物，能促进胰岛 细胞增殖，产生胞内第二信使ｃＡＭＰ的原 β 理，利用酶联免疫法测定胞内ｃＡＭＰ的含量。结果：Ｅｘｅｎａｔｉｄｅ或融合蛋白ＧＧＨ刺激大鼠 胰岛 β 素瘤细胞ＲＩＮｍ５ｆ后，选用１００ｎｍｏｌ／ＬＩＢＭＸ作为ｃＡＭＰ保护剂，用ＤＰＢＳ为药物稀释剂，采用液 氮—１００℃反复冻融２次裂解细胞，最后用酶联免疫法可稳定的测定上清液中ｃＡＭＰ含量。结论： 成功改良了融合蛋白ＧＧＨ体外高通量生物学活性测定方法。运用此方法可快速鉴定融合蛋白 ＧＧＨ及其它ＧＬＰ１类似物的生物活性。 关键词　胰高糖素样多肽１ｃＡＭＰ　融合蛋白　酶联免疫法　胰岛 细胞 β 中图分类号　Ｑ３１ 　　胰高糖素样多肽１（ｇｌｕｃａｇｏｎｌｉｋｅｐｅｐｔｉｄｅ１，ＧＬＰ１） 在进一步研究过程中发现毕赤酵母表达该蛋白药物的 是一种肠促胰岛素（ｉｎｃｒｅｔｉｎ），主要在哺乳动物进餐后 过程中Ｎ端存在严重的降解现象，这不但造成了后续 由肠道Ｌ细胞分泌。ＧＬＰ１既能通过葡萄糖依赖的方 分离纯化的难度，也影响了药物分子的活性，更影响了 式促进胰岛素分泌、抑制胰高糖素分泌、减缓胃排空、 其成药性。这就需要我们进一步对重组毕赤酵母进行 增加饱腹感等作用维持血糖的稳定，又能刺激胰岛 β 培养方式及基因水平上的改变。范翰、陈其亮等对融合 细胞增殖、促进胰岛再生，且无胰岛素和磺脲类降糖药 蛋白ＧＧＨ在小鼠体内的药效学评价表明ＧＧＨ能促进胰 物的低血糖危险。ＧＬＰ１的特殊生理作用非常有助于 ［３４］ 岛 细胞增殖 ，产生特定的化学物质，如ｃＡＭＰ和胰 β 糖尿病的治疗，但其在体内极易被二肽酰肽酶 ＩＶ ［５］ 岛素等 。前期研究中路庆鹏等在毕赤酵母中敲除氨基 （ＤＰＰＩＶ）降解而失活，半衰期仅２～６ｍｉｎ。艾塞那肽 端蛋白酶基因ＳＴＥ１３，并利用ＧＬＰ１类似物能促进胰岛 （ｅｘｅｎａｔｉｄｅ）是人工合成的抗高血糖的多肽，其５３％的 β细胞增殖，产生胞内第二信使 ｃＡＭＰ的原理，用 氨基酸序列和ＧＬＰ１相同，不易被酶降解ＤＰＰＩＶ降解， Ｅｘｅｎａｔｉｄｅ或ＧＧＨ刺激大鼠 胰岛素瘤细胞ＲＩＮｍ５ｆ，采 β 被世界卫生组织（ＷＨＯ）列为除口服降糖药和胰岛素 用酶联免疫法的方法测定ｃＡＭＰ浓度来表征ＧＧＨ的生 降糖之外的治疗糖尿病药物，但其可能导致胰腺炎。 ［６］ 物活性 。但是在测定过程中发现ｃＡＭＰ容易降解、细 　　为了延长 ＧＬＰ１体内半衰期且降低其副作用，该