血管活性物质与受体在大鼠肝星形细胞的表达及白细胞介素10干预对.docVIP

血管活性物质与受体在大鼠肝星形细胞的表达及白细胞介素10干预对表达的影响作者：张莉娟，郑伟达，史美娜，王小众  【关键词】? 肝硬化;星形细胞;白细胞介素―10;内皮缩血管肽-1;受体,生长抑素;受体,血管紧张素;受体,前列腺素E;逆转录聚合酶链反应;大鼠 　　　摘要: 目的? 研究实验性大鼠肝纤维化时肝星形细胞（HSC）内皮素1（ET-1）、生长抑素受体2（SSR 2 ）、血管紧张素受体1（AT 1 ）、前列腺素E 2 受体（ER 2 ）的mRNA表达情况及外源性白细胞介素10（IL-10）干预对表达的影响。? 方法? 60只清洁级SD大鼠随机分为对照组、肝纤维化组和IL-10干预组。以CCl 4 腹腔内注射构建肝纤维化模型，并予IL-10腹腔内注射干预造模。于第7周和第11周分别随机选取一批大鼠，分离HSC并提取总RNA，以半定量RT-PCR方法检测其ET-1、SSR 2 、AT 1 和ER 2 表达。? 结果? 对照组HSC中不表达SSR 2 ;ET-1、AT 1 和ER 2 均有表达。随肝纤维化进展，ET-1、SSR 2 和AT 1 表达明显增强（P0.05），IL-10干预组则减弱（P0.05）;而ER 2 的表达在各组HSC中无明显差异（P0.05）。? 结论? 肝纤维化时HSC内ET-1、SSR 2 和AT 1 mR-NA表达增加;外源性IL-10可以抑制其表达。???? 　　关键词:? 肝硬化;星形细胞;白细胞介素―10;内皮缩血管肽-1;受体，生长抑素;受体，血管紧张素;受体，前列腺素E;逆转录聚合酶链反应;大鼠???????????????? 　　在肝纤维化和门静脉高压的发病过程中，肝窦血流阻力增加是主要的机制之一。肝星形细胞（HSC）和窦周的内皮细胞是调节肝窦血流的细胞因素。HSC位于Diss间隙，与内皮细胞和肝细胞紧密相连，且具有收缩性，在肝损伤后其收缩大大增强。HSC通过收缩舒张调节肝血窦和血流量的变化，使肝窦的血流阻力增加，引起门静脉高压。目前，血管活性物质对HSC的作用备受关注，血管活性物质对HSC的影响在临床肝纤维化和门脉高压的治疗中具有重要的指导意义。本研究拟观察大鼠肝纤维化时部分血管活性物质内皮素1（ET-1）、生长抑素受体2（SSR 2 ）、血管紧张素受体1（AT 1 ）、前列腺素E 2 受体（ER 2 ）在HSC内mRNA水平上的变化及白细胞介素10（IL-10）干预纤维化进程后其水平的变化。???? 　　1 材料与方法???? 　　1.1 实验动物 清洁级雄性SD大鼠60只［许可证号SCXK（沪）2002-0010］，质量300～400g，随机分为对照组（n=8只）、模型组（n=28只）和干预组（n=24只）。清洁级条件喂养，自由进食进水。??? 　　1.2 主要试剂 重组大鼠IL-10购自深圳晶美生物工程公司，DNA酶（DNaseI）购自北京华美生物公司，型胶原酶、Nycodenz购自Sigma公司，Pronase E购自Merck公司，DMEM培养基干粉购自Gibco公司，RNA抽提试剂盒购自美国Gentra公司，逆转录试剂盒及PCR试剂盒购自Promega公司，引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。 　　1.3 方法??? 　　1.3.1 制备模型 对照组大鼠腹腔内注射生理盐水，2mL/kg，每周2次。模型组、干预组大鼠腹腔内注射50%CCl 4 （溶于蓖麻油中），2mL/kg，每周2次;干预组从第3周起，在注射CCl 4 前20min予4μg/kg的IL-10腹腔内注射。??? 　　1.3.2 HSC的分离、鉴定 造模第7，11周，对照组随机选取4只大鼠，其余两组分别随机选取5只大鼠，参照文献［5］分离、鉴定及原代培养HSC。??? 　　1.3.3 总RNA抽提及逆转录 新分离的HSC按照RNA抽提试剂盒说明书进行操作，总RNA的D 260 /D 280 均在1.8～2.0。按cDNA合成试剂盒取1μg总RNA逆转录为cDNA。??? 　　1.3.4 PCR反应 加cDNA模板1μL，上、下游引物各10pmol以25μL反应体系进行扩增。PCR反应参数为:945min→94℃45s→72℃60s。设置β-actin为参照。引物及退火温度、循环数见表1。1.3.5 电泳和半定量分析 将PCR产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳，用凝胶成像系统（美国Alpha，IS2000-220）对DNA条带进行光密度扫描，以目的基因/β-actin的比值表示相对表达水平。??? 　　1.4 统计学处理 结果以均数±标准差表示。用SPSS10.0统计软件对资料进行方差分析。 　　表1? 目的基因PCR扩增的引物序列及部分反应参数　略?????????