TNF-α刺激下RNA结合蛋白HuR在大鼠心脏成纤维细胞中的表达变化.pdfVIP

· 820· 脏 杂 志 (ChinHeartJ)2011，23(6) TNF—OL刺激下RNA结合蛋白HuR在大鼠 心脏成纤维细胞中的表达变化 柏丹娜 ，高 群 ，高 延 ，张 隽 ，卫 国 ，刘媛媛 ，王海 昌 (1．解放军第323医院干一科 ，陕西 西安 710054；2．第四军医大学西京医院心内科，陕西 西安710032) 关键词 ：肿瘤坏死 因子 ；心脏成纤维细胞 ；人类抗原 R；RNA结合蛋 白 中图分类号：R392．12；R541 文献标识码：B 文章编号：1009-7236(2011)06—820—03 DOI：CNKI：61—1268／R1706．033 网络出版时间：2011．10—1417：06 网络出版地址：http：／／wm~s．enki．net／kcms／detail／61．1268．R1706．033．html 在心脏成纤维细胞 (cardiacfibroblasts，CFs)中，炎症信 7500荧光定量 PCR仪和LI—CORBiosciences公司奥德赛近 号通路的持续活化 ，尤其是肿瘤坏死 因子 (tumornecrosis 红外成像系统由第四军医大学生物化学与分子生物学教研 factor一仪，TNF一01)依赖的分子信号通路的激活介导了细胞一 室提供。 系列的病理变化 。，但其详细的机制尚不完全清楚，而随 1．2 方法 着研究不断进展 ，许多新的分子也在TNF一仅刺激的CFs中发 1．2．1 SD大鼠CFs培养及实验分组 无菌条件下，取 1—3d 挥了生物学效应。 sD大鼠的心脏、剪碎 ，用PBS漂洗后 ，于37℃在磁力搅拌下， RNA结合蛋白人类抗原 R(humanantigenR，HuR)是一 加入 1Og／II型胶原酶消化，每5～10min收集 1次消化液， 个近年来受到广泛关注的分子。通过与靶基因mRNA3UTR 直到消化液清亮。将收集的组织消化液以800r／min离心 区的富含腺苷酸和尿苷酸 (AU)元件 (adenylate．anduridy． 5min，弃上清用 DMEM培养基重悬。经 200目滤网过滤后， 1ate．richelements，AREs)结合，可增加 mRNA的稳定性 ，从而 收集过滤后的细胞，于 37％、50ml／LCO 及饱和湿度条件 调节靶基因mRNA的表达。研究表明，通过调节许多分子 下 、用含 100ml／LFBS的DMEM培养基培养60min，更换新 (如细胞周期相关蛋白、细胞因子、生长因子、肿瘤抑制因子 的培养液(差速贴壁法)去除心肌细胞。待细胞生长至近汇 及凋亡相关因子等)，HuR广泛参与了炎症、纤维化及肿瘤的 合时传代培养，实验采用第3代的细胞，以无血清DMEM培 发生、转移等 J。在CFs中，HuR的功能尚不清楚 ，在TNF一0．／ 养基培养24h后用倒置显微镜观察其形态特征。实验分为 诱导的炎症条件下，CFs中HuR的表达变化及其在细胞中的 TNF— 刺激组和对照组。TNF一仅的终浓度为 2O L。 分布情况尚待研究。 1．2．2 波形蛋白基因和肌钙蛋白基 因表达的 RT—PCR检测 本文通过实时定量PCR(Quantitativereal—timePCR，qRT— 用差速贴壁法分离成纤维细胞的过程中，除培养成纤维细 PCR)和 Westernblot，观察 了在 TNF一刺激下，大鼠CFs中 胞外 ，同时也收集心肌细胞 (Cardiomyocytes，CM)。以CM作 HuR表达的变化；通过对胞浆／胞核蛋 白的分离提取并用 为对照 ，使用RT—PCR法扩增 CFs特异表达的波形蛋白基因 Westernblot检测了HuR在 CFs胞浆 ／胞核的分布情况，为进 和CM特异表达的肌钙蛋白基 因。具体步骤如下 ：以TRIzol 一 步探讨 CFs中HuR的生物学功能奠定了基础。