miRNA在有无淋巴结转移结肠癌中的表达.pdfVIP

自美国Bio．Rad购得 ：miRNA标记试剂和杂交试剂 值为仪器 的默认 CT值 。PCR引物分别为通用引物 盒 自美 国Agilent公司购得 ；mirYanaRNA分离试剂 和特定引物 ，特定引物分别：miR。142—3p：5一GTGA— 盒 自美 国Ambion公司购得 ；GeneExpression洗涤缓 GATGAAGCACTGTAGCTC一3 ：U6：5 一TTCGTGAAC— 冲液 I和 GeneExpression洗涤缓冲液 Ⅱ均 自美 国 CGTTCCATA哪 一3。定量 PCR反应条件 ：95℃ 15 Agilent公司购得。引物合成由上海英骏生物技术有 min；接着进行 40个循环 ：94℃ 15s；55 30s；70oC 限公司完成。 30s。扩增产物经溶解曲线检测特异性。 1-3 方 法 1．4 统计学处理 1．3．1 总 RNA提取 采用 MicrosoftExcel的 t检验分析有无淋 巴结 将液氮冻存的标本取出后 ，用匀浆器在冰上研 转移结肠癌组 miRNA表达差异。P0．05为差异有 磨成匀浆 ，离心后取上清液 ，总RNA和 miRNA的抽 统计学意义。 提步骤按照mirVanaRNA分离试剂盒 的使用说 明 书进行。NanoDrop分光光度仪测定 A260／A280比 2 结 果 值和电泳检测确定样品总 RNA量和质量。 1．3．2 miRNA标记 和 纯化 2．1 总RNA抽提和纯化的结果 运用 CIP制备标记反应物 ，并利用 T连接酶标 6例肿瘤组织标本富集总 RNA 的A260／A280 记方法进 行 Cy3荧光标记 ，再用 MicroBioSpin6 比值均在 1．96～2．16范围内 电泳结果和质检综和 Columns进行纯化。 评定均为合格 ，符合芯片检测要求。 1．3．3 芯片杂交、清洗和扫描 2．2 基因芯片杂交结果 在带有 Cy3荧光标记 的miRNA样本 中加入 标记 、纯化后 miRNA和芯片杂交 ，用扫描仪对 10xGE阻断剂和 2×Hi—RPM 杂交缓冲液 ，并用杂 芯片进行扫描得到图像 ，运用 FeatureExtraction软 交仪及其配套旋转烘箱进行芯片杂交。杂交结束后分 件分析 miRNA在 6例结肠癌组织标本中的表达水 别将芯片在 GE洗涤缓冲液 I和GE洗涤缓冲液 Ⅱ 平 ，结果发现 ，与无淋 巴结转移的结肠癌相比，有淋 中清洗 5min。最后芯片用 AgilentMicroarrayScanner 巴结转移的结肠癌中上调表达 的miRNA有 4个 ，为 扫描仪进行扫描。 miR．21，miR．212，miR一33b*和 miR一886．3p：下调表 1-3-4 数据处理和生物信息学分析 达 的miRNA有 3个 ，为 miR．142—3p，miR．142—5p． 运用 FeatureExtraction软件对芯片图像进行分 miR一362．5p。见表 2。 析 ，将图