TFPI-2对人肝癌细胞生长增殖、凋亡及AFP合成的影响.pdfVIP

TFPI-2对人肝癌细胞生长增殖、凋亡及AFP合成的影响.pdf

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中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2011,31(12):33-38 TFPI.2对人肝癌细胞生长增殖、凋亡及 AFP合成 的影响木 秦晓林 徐 勇 范晓卿 李武县 匡文斌 成 风 涂植光 (1重庆医科大学检验医学院 临床检验诊断学教育部重点实验室 重庆 400016) (2广东省深圳市坪山区人民医院 深圳 518118) 摘要 目的:探讨TFPI一2基因对人肝癌细胞Hep3B生长增殖、凋亡及甲胎蛋白AFP表达的影响。 方法:将重组质粒 PCDNA3.1一TFPI.2转染Hep3B细胞并经 G418稳定筛选后,RT—PCR和Western blot检测转染前后TFPI-2mRNA和蛋 白表达水平,采用CCK一8法、生长曲线观察TFPI一2对人肝癌 细胞Hep3B生长增殖的影响,通过平板克隆形成实验观察单个细胞的增殖能力,RT—PCR检测 AFPmRNA的表达,并用电化学发光法测定培养上清液中甲胎蛋白AFP含量,流式细胞仪检测细 胞早晚期凋亡情况。结果:转染成功的Hep3B细胞检测到TFPI一2mRNA和蛋 白的表达;与转染空 载体及未转染的细胞相比,转染TFPI-2的细胞生长增殖能力明显减弱;AFPmRNA表达抑制率为 16.51%,AFP蛋 白分泌明显低于对照组(P0.01);流式细胞术检测转染TFP1-2的Hep3B细胞 早期凋亡率明显增加 (24.03%±7.28%vs8.77%-4-3.66%)。结论:TFP1.2表达可显著抑制肝癌 细胞生长和AFP的表达,同时还能诱导细胞早期凋亡。为进一步探讨靶向TFPI一2的肝癌基因治 疗提供 了实验依据。 关键词 肝癌 组织因子途径抑制物.2 细胞增殖 甲胎蛋白 细胞凋亡 中图分类号 Q819 肝细胞肝癌 (hepatocellularcarcinoma,HCC)为 目 1 材料与方法 前世界范围内发生率最高的原发性恶性肿瘤之一 , 在我国也是最常见的恶性肿瘤,它是肝硬化的主要并 1.1 材 料 发症。其特点是高侵袭性和高转移性 。人组织因 1.1.1 试剂 MEM培养基、胎牛血清及非必需氨基酸 子途径抑制物-2(humantissuefactorpathwayinhibitor-2, (NEAA)购于Hyclone公司,去内毒素质粒小提试剂盒 TFPI一2),是一种 Kuntiz型蛋白酶抑制剂 ,可抑制降 购 自OMEGA公司,G418、Trizol试剂和 Lipofectamine 解细胞外基质的多种蛋 白酶。我们 的前期研究表明 2000均购 自Invitrogen公司,RT.PCR两步法试剂盒购 TFPI一2在肝癌中低表达 ,在肝癌的发生、发展及转移 自TaKaRa公司,RIPA细胞裂解液购 自北京百泰克生 中起重要作用 ,可望成为肝癌治疗靶点之一。本研 物科技公司,抗人TFP1-2单克隆抗体购 自美国R&D 究以初步研究结果为依据 ,采用重组 DNA技术构 公司,抗B—actin单克隆抗体购 自ProteinTechGroup,羊 建 TFP1-2真核表达载体,通过转染人肝癌细胞 Hep3B, 抗鼠lgG抗体购 自深圳中晶生物科技公司,CCK一8细胞 过表达TFPI一2,探讨其对人肝癌细胞生长增殖、凋亡及 计数试剂盒购 自同仁化学研究所,AnnexinV—EGFP细 HCC标志甲胎蛋白AFP表达的作用。 胞凋亡检测试剂盒购 自南京凯基生物公司。 1.1.2 细胞株及质粒 人肝癌细胞株 Hep3B购 自中 收稿 日期:2011-08-09 修回日期 :2011-09—14 国科学院肿瘤细胞库,PCDNA3.1一TFP1-2真核表达载 深圳市科技计划资助项 目(200902013) 体由深圳市人民医院临床研究中心构建。 $通讯作者,电子信

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